[發明專利]利用硅膠吸附醌類物質降低植物細胞褐化風險的方法

在審

• 申請號: 201410100844.3
• 申請日: 2014-03-18
• 公開（公告）號: CN103923873A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發明（設計）人: 苗辰飛;朱閃爍;苗志奇
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 牛山;陳少凌

技術領域

本發明屬于植物細胞的生物學領域，具體涉及一種利用硅膠吸附醌類物質降低植物細胞褐化風險的方法。

背景技術

植物次生代謝物大多具有細胞生理調節能力，是重要的藥物或者藥物前體，比如紅豆杉中的抗癌藥物紫杉醇等。但由于紅豆杉資源稀少，屬于國家保護植物，禁止砍伐天然林木。在天然或者人工種植的紅豆杉植株中，紫杉醇含量非常低，在萬分之一以下，因此分離紅豆杉細胞，在人工條件下進行細胞培養，可精確調控細胞微環境，便于脅迫誘導，紫杉醇生產能力遠高于紅豆杉種植，已經成為一種高效、環境友好、可持續的紫杉醇商業化生產方式。

但和其他植物細胞培養一樣，紅豆杉細胞在培養過程中經常發生褐化。褐化是植物細胞在特定環境下，激活酚類物質合成，并進一步將其氧化為具有細胞毒性的紅褐色的醌類物質，從而殺滅已感染的自身細胞和外來微生物的一種保護機制。但在細胞培養過程中，輕微的褐化會引起細胞代謝活力、生長速度和紫杉醇等藥用成分生產能力的下降，頻繁而嚴重的褐化甚至造成細胞壞死，導致紅豆杉細胞培養失敗。紅豆杉細胞酚類物質含量高，在人工培養過程中更容易發生褐化，特別是在低密度接種、培養初期以及培養條件和培養基組成發生調整改變時。因此如何抑制或者避免褐化，提高細胞培養的穩定性和保證其生產的高效性，成為紅豆杉細胞培養生產紫杉醇成功的關鍵技術。

發明內容

本發明的目的在于針對褐化引起的植物細胞(尤其是紅豆杉細胞)培養體系不穩定和生產能力下降問題，提供一種利用硅膠吸附醌類物質降低植物細胞褐化風險的方法。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

本發明涉及一種利用硅膠吸附醌類物質降低植物細胞褐化風險的方法，所述方法包括如下步驟：

步驟1，制備特定形狀的硅膠吸附材料，滅菌、備用；

步驟2，在細胞培養過程中使所述硅膠吸附材料和植物細胞培養物充分接觸，硅膠吸附材料吸附醌類物質后轉變為紅褐色；

步驟3，當吸附達到飽和(硅膠吸附材料的紅褐色不再加深)或者培養結束后，取出硅膠吸附材料。

優選地，所述植物細胞為紅豆杉細胞。這是由于紅豆杉細胞酚類物質含量高，在人工培養過程中更容易發生褐化。所述硅膠材料吸附醌類物質的條件為在整個培養過程中保持硅膠吸附材料和紅豆杉培養體系的充分接觸，使得醌類物質從紅豆杉細胞培養液轉移吸附到硅膠材料上。硅膠材料由于吸附大量的醌類物質而變成紅褐色。醌類物質從發酵液到硅膠材料的轉移吸附降低了紅豆杉細胞微環境中醌類物質的含量，避免了紅豆杉細胞代謝能力以及細胞活力的下降，保證了紅豆杉細胞的正常生長和生產。

優選地，步驟1中，所述硅膠吸附材料為醫用或者食品級硅膠。以避免具有細胞毒性雜質的混入。

優選地，所述硅膠吸附材料的特定形狀為棒狀、管狀、顆粒狀、多孔海綿狀或細胞培養所用的發酵罐罐體形狀。特定形狀的選擇依據在于：提高吸附效率，并方便和培養物分離。

優選地，步驟3中，所述硅膠吸附材料能夠與植物細胞培養物分離。吸附飽和后的硅膠吸附材料可以和植物(紅豆杉)培養主體方便地分離，便于回收。對于顆粒狀硅膠吸附材料，可以通過過濾、離心的方式利用硅膠材料和植物(紅豆杉)細胞間大小或者密度的差別進行分離。對于棒狀、管狀、多孔海綿狀以及直接用硅膠材料制作細胞培養培養所用的發酵罐罐體形式的硅膠吸附材料，可以采用直接取出硅膠吸附材料或者傾倒出細胞培養物的方式方便分離硅膠吸附材料和植物(紅豆杉)培養物。

優選地，所述方法還包括如下步驟：采用醇類溶劑洗脫再生所述步驟3的硅膠吸附材料。洗脫后硅膠吸附材料紅褐化消失，恢復到原來的顏色，實現硅膠吸附材料再生。

優選地，所述醇類溶劑為乙醇。將吸附飽和后的硅膠吸附材料浸泡在乙醇中半小時以上，所吸附的醌類物質脫附溶解到乙醇中，乙醇呈現紅褐色，而硅膠吸附材料恢復到原來的顏色。如果吸附的醌類物質過多，可以采用反復多次乙醇洗脫的方式再生硅膠材料。

優選地，所述方法可與銀離子誘導法聯合使用，用以提高紫杉醇產量。

與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果：

(1)本發明所述方法實施成本低。和添加抗氧化劑相比較，硅膠材料價格更低，且可以再生和重復利用。

(2)本發明所用材料更安全。所用硅膠材料為醫用或者食品級硅膠，不含細胞毒性物質，細胞相容性好，既不會影響紅豆杉細胞正常生長和生產，也不會給最終的紫杉醇藥品中帶入有害雜質。