[發明專利]用于二惡英類物質生物檢測的重組載體和細胞

有效

• 申請號: 201410100654.1
• 申請日: 2014-03-18
• 公開（公告）號: CN103834689B
• 公開（公告）日: 2016-11-30
• 發明（設計）人: 趙斌;李帥章;謝群慧;鄭明輝;裴新輝;周志廣
• 申請（專利權）人: 中國科學院生態環境研究中心
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;C12Q1/68;C12Q1/66;C12Q1/02;C12R1/91
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 劉向昕

技術領域

本發明涉及一種重組載體和重組細胞，具體涉及一種用于二惡英類物質生物檢測的重組載體以及包含該重組載體的重組細胞。本發明還涉及所述重組載體和細胞在二惡英類物質生物檢測方面的用途。

背景技術

環境污染問題一直伴隨著人類社會的發展進程而日益復雜化及多樣化，這使得環境污染對人類的健康所帶來的負面影響也日益嚴重。世界衛生組織（WHO）在其《2004年世界衛生報告》中指出在全球范圍內估計24%的疾病負擔(健康壽命年損失)和23%的所有死亡(早逝)可歸因于環境因素，而其中最主要的因素之一就是日益加劇的化學污染物。在眾多的化學污染物中，持久性有機污染物（POPs）因為其自身的物化特性和對人類健康的嚴重威脅受到全球極大的重視。

二惡英類化合物（Dioxins）是一類典型的持久性有機污染物，也是斯德哥爾摩公約中首批被列入對人類健康和生態環境有害的持久性有機污染物。國際癌癥研究中心已將其列為人類一級致癌物。持久性有機污染物（POPs）具有生物蓄積性、半揮發性和持久性等特點（Vallack?etal.,1998;Jonesand?de?Voogt,1999）。151個國家的政府簽署的斯德哥爾摩公約“關于持久性有機污染物”，旨在消除或控制至少12種持久性有機污染物（環境署，2006年）。根據本公約，建立持久性有機污染物的排放清單是強制性的，這為進一步減少排放量奠定基礎。因此，在環境中持久性有機污染物監測是重要的第一步（WHO，1999）。其中，持久性有機污染物，多氯二苯并二惡英（PCDDs）、多氯二苯并呋喃（PCDFs）和多氯聯苯（PCBs），即所謂的“二惡英類化合物”，是目前公開的監管和科學關注對象，因為這些化合物具有廣泛的毒性效應，包括免疫毒性、發育毒性、生殖毒性、神經毒性和致癌性（Kerkvliet,1995;Brouwer,1991;Nebert?et?al.,1993）。

高分辨率氣相色譜/質譜被認為是分析二惡英類物質的黃金標準方法。高分辨液相質譜連用具有靈敏度高、結果準確等優點，但是檢測費用相當高昂，并且檢測周期長，需要樣品量大，使其在環境、食品和衛生等領域開展二惡英類化合物污染狀況篩查中的應用受到一定限制。另外，由于化學分析僅限于17種二惡英/呋喃的風險評估，而對其他的有毒多鹵代芳香烴化合物（PHAHs），包括氟化、溴代和混合鹵化二惡英/呋喃以及偶氮、氧化偶氮化合物、聯苯醚、萘、硫類似物等二氧芑類物質和烷基化的二氧芑類物質則不能指示。此外，化學方法會忽略二惡英類化合物潛在的協同或拮抗作用。在環境中，二惡英類化合物共存的復雜性以及各種同系物的混合物和多級二惡英類化合物之間的相互作用可以調節他們的潛在毒性。大量的研究表明二惡英類化合物和非添加劑之間的相互作用（Davis?and?Safe,1990;Harper?et?al.,1995）。因此，化學分析既不高通量監測環境二惡英類化合物也不適合生物毒性的預測，急需要快速而廉價的生物檢測方法。

為了克服化學分析方法的限制，國際上已經開發出各種生物檢測法，主要包括：EROD（ethoxyresorufin-O-deethylas）、ELISA（enzyme-linked?immunosorbent?assay）和CALUX（chemical-activatedluciferase?expression）。這些生物測定的方法是根據多項研究成果(Nebert?et?al.,1993;Lucieret?al.,1993;Safe,1990;Schmidt?andBradfield,1996)。二惡英類化合物的毒性是通過芳香烴受體（AHR）配體依賴的轉錄因子介導的(Nie?et?al.,2001)。目前二惡英類化合物結合芳香烴后，芳香烴受體復合物進行變構和AHR核轉運蛋白（ARNT）二聚合相互作用。這種異源性的配體復合物（AhR-Arnt）結合到基因啟動區的二惡英反應元件（DRE）上，DRE序列的結合導致DNA彎曲、干擾染色質和和核小體，從而激活基因的轉錄。隨后，P4501A1蛋白合成增加并誘導P4501A1酶活性增加，然后產生一系列生物學反應和毒性效應。因此，分析P4501A1依賴的EROD酶活性變化可以指示外源物質的影響。但是，EROD法靈敏度低，限制了其應用范圍。ELISA法有很好的特異性，然而該方法不能反映樣品的總毒性當量，而且檢測過程都需要大量而且昂貴的抗體，增加了檢測成本。CALUX法成本低，而且靈敏度高，被認為是最好的生物檢測二惡英類物質的生物方法。