[發明專利]用于二惡英類物質生物檢測的重組載體

無效

• 申請號: 201410099508.1
• 申請日: 2014-03-18
• 公開（公告）號: CN103820496A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 趙斌;裴新輝;謝群慧
• 申請（專利權）人: 中國科學院生態環境研究中心
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;C12Q1/68;C12Q1/66;C12Q1/02
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 劉向昕

技術領域

本發明涉及一種重組載體，具體涉及一種用于二惡英類物質生物檢測的重組載體以及包含該重組載體的細胞。本發明還涉及所述重組載體和細胞在二惡英類物質生物檢測方面的用途。

背景技術

二惡英（Dioxin）是持久性有機污染物（POPs）的一種，以其強烈的毒性及對生物體巨大的危害而被稱為“世紀之毒”。

就目前二惡英的檢測方法而言，一般來說有兩大類方法，即儀器分析法和生物分析法。上世紀90年代美國環境保護局公布的檢測二惡英的標準方法US?EPA?Method1613和1618界定了用高分辨氣相色譜-高分辨質譜（HRGC-HRMS）聯機檢測二惡英，該方法也被公認為是鑒定和定量二惡英的“黃金標準”方法。這種方法雖然準確，但是成本高，檢測周期長，而且需要一定的專業技術人員，因此限制了這種方法的的應用性。

而生物檢測方法普遍具有價格低廉、高通量和便于推廣應用等特點，近年來在全球范圍內得到了飛速的發展和應用。如果從所使用的檢測體系來分類，生物檢測方法大致可以分為體內法和體外法兩大類。體內法是利用活體動物，比如說小鼠、斑馬魚等等，通過檢測其生物學標記物表達的變化或其生理指標的變化來檢測二惡英類化合物。雖然任何化合物毒性的最后確定都需要體內法，但這種方法費時費力費錢，并不適合大規模篩查。第二大類，就是體外法。簡單的講就是脫離動物活體，以細胞或者抗體等簡單的手段檢測二惡英的含量，狹義地講二惡英的生物分析方法就是指的體外法。在體外法中，又可以根據其基本原理分為兩大類：一類是基于二惡英毒性信號通路的，主要包括基于CYP1A1酶活的EROD法、和基于報告基因的CALUX法；另外一類是基于二惡英抗體酶聯免疫反應的，包括酶聯免疫測定法（ELISA）、熒光免疫測定法（DELFIA）等。而CALUX是這些生物檢測方法中最靈敏的，也是其中具有代表性的檢測方法之一。

CALUX法靈敏度高、通量高、便于操作，已在很多國家和地區得到了實際應用。目前發達國家包括美國、歐盟、日本相繼建立和完善了各國自己的基于該方法的標準，例如US?EPA?Method4435；EU?Commission?Regulation?NO1883/2006等等。目前CALUX技術的最低檢測閾值（MDL）已經可以達到1pM，而半數效應濃度（EC50）則已經達到20pM，已經達到了儀器分析的靈敏度，顯示了其良好的應用價值。

CALUX法的基本原理是：二惡英進入細胞后與細胞質內的芳香烴受體（AhR）結合并活化該受體，活化的AhR進核并與芳香烴受體核轉位蛋白（ARNT）結合，而后AhR:ARNT異源二聚體可以直接充當轉錄因子結合于一些基因啟動子區中的二惡英反應元件（DRE）上從而調控這些基因的表達水平。在這些基因中，CYP1A1是目前公認的二惡英反應標記物。所以將CYP1A1啟動子中的富含DRE的區段克隆下來，并插入到小鼠乳腺瘤病毒（MMTV）啟動子的調控區域，最后把這個重組啟動子構建于報告基因上游，那么二惡英就可以誘導報告基因的表達了，這就是CALUX法的基本原理。

CALUX使用MMTV作為重組啟動子的骨架既有優點又有缺點，優點是MMTV本身是強啟動子所以在一定程度上可以放大二惡英反應的信號，缺點是MMTV啟動子區域很長，可能還會受到未知其他轉錄因子的調控，增加了該生物檢測系統的不確定性。而且在實際應用中，人們的確發現了利用該系統檢測一些環境樣品時其報告基因反應值高于飽和濃度二惡英標準品2,3,7,8-四氯二苯并二惡英（TCDD）的反應值，這表明一些環境樣品中的確存在一些未知的化合物通過活化MMTV區段或其他區段而誘導了報告基因的表達。

根據二惡英類物質生物檢測的現狀并結合我國檢測設備和水平較落后的具體情況，仍需開發成本低廉、靈敏度高以及克服現有系統缺陷的二惡英類物質生物報告檢測方法。

發明內容

本發明的發明人經過大量實驗，提供了改進的二惡英類化合物生物報告檢測載體和細胞，由此完成了本發明。

本發明第一方面涉及重組載體，所述載體沿著其基因轉錄的方向可操作地連接有CYP1A1啟動子及報告基因，所述啟動子調節該報告基因的轉錄。

根據本發明第一方面任一項的重組載體，其中所述的CYP1A1啟動子為哺乳動物CYP1A1啟動子，例如為小鼠、豚鼠或人的CYP1A1啟動子。在本發明的實施方案中，所述CYP1A1啟動子為小鼠CYP1A1啟動子。

根據本發明第一方面任一項的重組載體，其中所述CYP1A1啟動子的序列例如為SEQ?ID?NO：3所示的序列。