[發(fā)明專利]一種原位檢測(cè)半纖維素在植物細(xì)胞壁分布的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410099500.5
• 申請(qǐng)日: 2014-03-18
• 公開（公告）號(hào): CN103822931A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許鳳;馬靜;周霞;吉喆;張遜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京林業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N23/04
• 分類號(hào): G01N23/04
• 代理公司: 北京鼎佳達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11348
• 代理人: 王偉鋒;劉鐵生

1.一種原位檢測(cè)半纖維素在植物細(xì)胞壁分布的方法，包括以下步驟：

（1）對(duì)植物組織進(jìn)行切割，形成植物組織塊；

（2）對(duì)植物組織塊進(jìn)行固定；將植物組織塊浸入固定液中進(jìn)行固定；固定過程在室溫下進(jìn)行，先在真空條件下保持30～60min，之后在常壓下保持4小時(shí)；

（3）對(duì)植物組織塊進(jìn)行洗滌；將固定后的植物組織塊浸入50mM的二甲胂酸鈉緩沖溶液中進(jìn)行洗滌；室溫常壓下保持10min；洗滌重復(fù)3次；

（4）對(duì)植物組織塊進(jìn)行脫水；將洗滌后的植物組織塊依次浸入30v/v%乙醇水溶液1次，50v/v%乙醇水溶液1次，70v/v%乙醇水溶液1次，80v/v%乙醇水溶液1次，90v/v%乙醇水溶液1次，95v/v%乙醇水溶液3次，100%乙醇3次進(jìn)行脫水；室溫常壓下每次浸入10min；

（5）對(duì)植物組織塊進(jìn)行滲透；將脫水后的植物組織塊依次浸入50%LR?White樹脂中1次，100%LR?White樹脂中2次進(jìn)行滲透；室溫下，每次滲透處理先在真空度為-0.098MPa條件下保持30～60min，之后在常壓下保持10～12小時(shí)；

（6）對(duì)植物組織塊進(jìn)行包埋聚合；將滲透后的植物組織塊浸入注滿LR?White樹脂的膠囊中，然后將膠囊置于55～60℃烘箱中，常壓下保持18～24小時(shí)；

（7）對(duì)包埋后的植物組織塊進(jìn)行超薄切片，然后將所得植物組織超薄切片收集在鎳網(wǎng)上；

（8）對(duì)鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行洗滌；室溫條件下，將鎳網(wǎng)的載片面依次輕浮于去離子水的液滴上、含0.1M甘氨酸的0.01M磷酸鹽的緩沖溶液的液滴上、去離子水的液滴上和0.01M磷酸鹽緩沖溶液的液滴上進(jìn)行洗滌；對(duì)應(yīng)的洗滌次數(shù)和時(shí)間分別為：去離子水洗滌2次，每次2min；含0.1M甘氨酸的0.01M磷酸鹽的緩沖溶液洗滌1次，30min；去離子水洗滌4次，每次2min；0.01M磷酸鹽緩沖溶液洗滌4次，每次2min；

（9）對(duì)鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行封閉；將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于含有羊血清的0.01M磷酸鹽緩沖溶液的液滴上進(jìn)行封閉，室溫下保持40min；

（10）對(duì)鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行第一抗體孵育；將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于第一孵育液內(nèi)進(jìn)行孵育，所述第一孵育液含有0.01M磷酸鹽緩沖溶液、第一抗體和1w/v%牛血清蛋白；置于無菌的玻璃培養(yǎng)皿中并加蓋，在4℃冰箱中孵育2天；

（11）對(duì)鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行洗滌；先用注射器吸取含有1w/v%牛血清蛋白的0.01M磷酸鹽緩沖溶液沿鎳網(wǎng)面沖洗1分鐘；再將鎳網(wǎng)的載片面依次輕浮于0.01M磷酸鹽緩沖溶液、pH為7.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、pH為8.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液的液滴上進(jìn)行洗滌；對(duì)應(yīng)的洗滌次數(shù)和時(shí)間分別為：0.01M磷酸鹽緩沖溶液洗滌5次，每次2min；pH為7.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液洗滌4次，每次1min；pH為8.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液洗滌4次，每次1min；

（12）對(duì)鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行第二抗體孵育；將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于第二孵育液內(nèi)進(jìn)行孵育，所述第二孵育液含有0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、第二抗體和0.5w/v%牛血清蛋白；置于無菌的玻璃培養(yǎng)皿中并加蓋，室溫孵育4小時(shí)；

（13）對(duì)鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行洗滌；先用注射器吸取0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液沿鎳網(wǎng)面沖洗1分鐘；再將鎳網(wǎng)的載片面依次輕浮于pH為7.6的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、pH為7.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、去離子水的液滴上進(jìn)行洗滌；對(duì)應(yīng)的洗滌次數(shù)和時(shí)間分別為：pH為7.6的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液洗滌5次，每次4min；pH為7.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液洗滌5次，每次4min；去離子水洗滌4次，每次1min；

（14）對(duì)鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行染色；將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于雙氧乙酸鈾的液滴上進(jìn)行染色，室溫下保持10min；

（15）對(duì)鎳網(wǎng)的載片面洗滌后使用透射電子顯微鏡觀察。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原位檢測(cè)半纖維素在植物細(xì)胞壁分布的方法，其特征在于，步驟1中將植物組織切割成大小為長(zhǎng)0.5mm?x寬0.5mm?x高5mm的植物組織塊。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原位檢測(cè)半纖維素在植物細(xì)胞壁分布的方法，其特征在于，步驟（2）中所述固定液為含4w/v%多聚甲醛和0.1v/v%戊二醛的溶液。