[發(fā)明專利]一株利用蔗糖產(chǎn)丁二酸基因工程菌株及其發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410099403.6
• 申請日: 2014-03-18
• 公開（公告）號: CN103937733B
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 姜岷;李鳳;劉嶸明;梁麗亞;馬江鋒;陳可泉;韋萍;歐陽平凱
• 申請（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/63;C12P7/46;C12R1/19
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務(wù)所32230
• 代理人: 徐蓓

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株產(chǎn)丁二酸基因工程菌及其發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，具體是一株高效利用蔗糖和糖蜜生長并產(chǎn)丁二酸重組菌株及利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法。

背景技術(shù)

丁二酸(succinic acid)又稱琥珀酸，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、染料、香料、油漆、食品和塑料等行業(yè)，作為C4平臺化合物，可用于合成1,4-丁二醇、四氫呋喃、γ-丁內(nèi)酯等有機化學(xué)品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)類生物可降解材料，被美國能源部認為是未來12種最有價值的生物煉制產(chǎn)品之一。

丁二酸的生產(chǎn)方法主要包括化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法，利用微生物發(fā)酵法轉(zhuǎn)化可再生資源，由于原料來源廣泛且價格低廉，污染小，環(huán)境友好，且在發(fā)酵過程中可以吸收固定CO₂，能有效緩解溫室效應(yīng)，開辟了溫室氣體二氧化碳利用的新途徑，今年來成為研究的熱點。丁二酸的生產(chǎn)菌株主要集中在Anaerobiospirillum succiniciproducens、Actinobacillus succinogenes、Mannheimia succiniciproducens、重組谷氨酸棒桿菌和重組大腸桿菌。其中利用野生菌株生產(chǎn)丁二酸雖然獲得了較高的產(chǎn)物濃度，但培養(yǎng)過程培養(yǎng)基成本較高，且甲酸、乙酸等副產(chǎn)物積累較多，阻礙了其工業(yè)化進程。而重組大腸桿菌由于遺傳背景清楚、易操作、易調(diào)控、培養(yǎng)基要求簡單和生長迅速等優(yōu)點，近年來被廣泛用于研究以獲得產(chǎn)丁二酸優(yōu)秀菌株。

現(xiàn)有產(chǎn)丁二酸重組大腸桿菌的構(gòu)建思路主要包括失活副產(chǎn)物生成途徑的關(guān)鍵酶(如丙酮酸甲酸裂解酶與乳酸脫氫酶)、增強丁二酸合成途徑中酶(如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)的活性以及外源導(dǎo)入可以引導(dǎo)合成丁二酸的酶(如丙酮酸羧化酶)提高其對葡萄糖的利用率以及生產(chǎn)速率。其中，E.coli NZN111由于同時失活了丙酮酸甲酸裂解酶與乳酸脫氫酶，NADH不能及時再生為NAD⁺，引起胞內(nèi)輔酶NAD(H)的不平衡(NADH/NAD⁺比例超過2)，最終導(dǎo)致厭氧條件下菌株不能利用葡萄糖。其自發(fā)突變株E.coli AFP111由于突變了葡萄糖專性轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中的ptsG基因，降低了在EMP途徑中NADH的產(chǎn)生速率，恢復(fù)了NAD(H)平衡，使得菌株在厭氧條件下能夠利用葡萄糖，且產(chǎn)物主要為丁二酸，在有氧厭氧兩階段發(fā)酵培養(yǎng)AFP111過程中，丁二酸質(zhì)量收率達到96％，生產(chǎn)強度為1.21g L^-1·h^-1。

作為生產(chǎn)生物化工產(chǎn)品的原料，蔗糖比葡萄糖具有經(jīng)濟和環(huán)境優(yōu)勢。蔗糖是由葡萄糖和果糖組成的二糖，是光合作用的主要產(chǎn)物，廣泛分布于植物體內(nèi)，特別是甜菜、甘蔗和水果中含量極高。由于生產(chǎn)原料和工藝的優(yōu)勢，蔗糖的價格遠遠低于葡萄糖的價格。

除此以外，蔗糖也可以保護細胞免受氧化、溫度、酸、壓力的影響，所以作為碳源發(fā)酵可以提高生物產(chǎn)品的形成(Lee,Jeong Wook,et al.2010)。

糖蜜是工業(yè)制糖過程中，蔗糖結(jié)晶后，剩余的不能結(jié)晶，但仍含有較多糖的液體殘留物，其中主要含有大量的可發(fā)酵糖(主要為蔗糖)，因而是很好的發(fā)酵原料。按制糖原料不同可分為甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜等。各種糖蜜的營養(yǎng)成分有差異。一般甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜以轉(zhuǎn)換糖量表示，其總糖量分別為48.0％、49.0％；水分25.0％、23.0％；粗蛋白質(zhì)3.0％、6.5％。所以蔗糖和糖蜜是極其豐富且廉價的碳源。

大腸桿菌廣泛應(yīng)用于工業(yè)，但目前大多數(shù)大腸桿菌由于缺少蔗糖利用基因，從而不能利用蔗糖。但大腸桿菌原始菌中E.coli W、EC3132和O157：H7可以以蔗糖為唯一碳源生長。蔗糖利用系統(tǒng)主要分為PTS蔗糖利用系統(tǒng)和非PTS蔗糖利用系統(tǒng)。E.coli W中蔗糖主要通過非PTS系統(tǒng)被利用的，其中包括cscBKAR四個基因。具體而言，基因cscR編碼阻遏蛋白(CscR)，基因cscA編碼蔗糖水解酶(CscA)，基因cscK基因編碼果糖激酶(CscK)，基因cscB編碼蔗糖通透酶(CscB)。cscR會影響蔗糖的利用，所以將E.coli W中的非PTS蔗糖利用系統(tǒng)引入到不能利用蔗糖的大腸桿菌時，不需要引入cscR。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供了一株高效利用蔗糖和糖蜜生長并產(chǎn)丁二酸大腸桿菌菌株，并利用該菌株厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，達到菌株的方法簡單方便，得到的菌株發(fā)酵方法簡單可行，易于工業(yè)化，產(chǎn)酸能力強的目的，從而大大降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟效益。

為實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：