[發(fā)明專利]免疫熒光法檢測HLA-DR表達(dá)量評(píng)估PBMC抗原呈遞能力的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410098829.X
• 申請(qǐng)日: 2014-03-18
• 公開（公告）號(hào): CN103869082A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 刁宏燕;陳佳寧;魏應(yīng)鳳;崔光瑩;丁玉龍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司 33212
• 代理人: 周世駿

1.免疫熒光法檢測HLA-DR表達(dá)量評(píng)估PBMC抗原呈遞能力的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）從感染甲型H7N9的患者外周血中分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞，即PBMC；

（2）通過免疫熒光檢測HLA-DR的表達(dá)量；

（3）當(dāng)HLA-DR占外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMC的比例為27.56%～37.10%時(shí)，表示外周血單個(gè)核細(xì)胞抗原呈遞能力處于正常范圍；當(dāng)HLA-DR占外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMC的比例低于27.56%時(shí)，表示外周血單個(gè)核細(xì)胞呈遞能力弱。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1）具體包括：

A、H7N9患者血的收集：

收集重癥H7N9患者的外周靜脈血全血樣本至少10例、輕癥H7N9患者的外周靜脈血全血樣本至少10例；患者已通過年齡、體溫指標(biāo)及根據(jù)臨床表現(xiàn)評(píng)估的APACHEⅡ和PMEWS評(píng)分明確診斷患有重癥或輕癥H7N9病毒感染；另外收集健康體檢對(duì)照者全血；

B、患者PBMC的分離：

將收集到的全血樣本置于離心機(jī)中，3000rpm離心5分鐘；吸出血漿后，將剩余血細(xì)胞液加入到已放入等體積PBS的15毫升離心管中充分混勻；將混勻后的液體沿離心管壁緩慢加入到已放入與PBS等體積的人淋巴細(xì)胞分離液，注意不要與淋巴細(xì)胞分離液混合；上述操作完成后，將離心管置入離心機(jī)2000rpm離心20分鐘，取出后，吸取中間“白毛”層到已放入PBS的離心管中，洗去多余雜質(zhì)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（2）具體包括：

A、細(xì)胞涂片的制備：

將收集的PBMC配成濃度為10⁶/ml的細(xì)胞懸液，吸出20微升液體滴于多聚賴氨酸處理過的載玻片的中間，做好相應(yīng)標(biāo)記；置于烘箱37度烘干后，PBS洗3遍，洗的過程注意輕柔；隨后將玻片置于4%多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗5遍，烘干；隨后向載破片上滴約20微升已配制好的一抗液體，室溫孵育30分鐘，PBS洗5遍，烘干；滴上二抗液體20微升，室溫孵育20分鐘，PBS洗5遍，烘干；滴上封片液，只需蓋過涂有細(xì)胞的部分，蓋上蓋玻片，封片；

B、熒光顯微鏡下觀察被熒光抗體染上顏色的細(xì)胞，拍照，處理圖像。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（2）具體包括：

A、細(xì)菌懸液的制備和細(xì)菌核的染色：

將大腸桿菌菌株接種至LB培養(yǎng)板，于37攝氏度孵箱培養(yǎng)24小時(shí)后收集細(xì)菌，洗去雜質(zhì)和死菌，棄去上清液體，加入配置好的4%多聚甲醛固定20min，洗去固定液后配置成10⁹/ml細(xì)菌懸液，每毫升細(xì)菌懸液中加3微升DAPI染色液染色10min，隨后待PBS洗凈染色液后，制備成濃度為10⁹/ml的細(xì)胞懸液；

B、單核細(xì)胞對(duì)細(xì)菌抗原的吞噬作用：

將上述分離的PBMC以10⁶/ml的濃度與細(xì)菌以1：10的比例按需加入培養(yǎng)板中，共分成兩孔，置于37攝氏度培養(yǎng)3小時(shí)；

C、單核細(xì)胞吞噬細(xì)菌后的抗原呈遞能力的流式檢測：

將前一步驟中培養(yǎng)板一孔的PBMC和細(xì)菌混合液取出，PBS洗去多余雜質(zhì)，定容成500微升加入流式管置于流式細(xì)胞儀上樣架，選擇相應(yīng)通道上機(jī)檢測CD14和大腸桿菌指標(biāo)的表達(dá)量；

D、單核細(xì)胞吞噬細(xì)菌后的抗原呈遞能力的免疫熒光檢測：

將培養(yǎng)板另一孔的PBMC和細(xì)菌混合液取出，PBS洗去多余雜質(zhì)，吸出20微升液體滴于多聚賴氨酸處理過的載玻片的中間，做好相應(yīng)標(biāo)記；置于烘箱37度烘干后，PBS洗3遍，洗的過程注意輕柔；隨后將玻片置于4%多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗5遍，烘干；隨后向載破片上滴約20微升已配制好的一抗液體，室溫孵育30分鐘，PBS洗5遍，烘干；滴上二抗液體20微升，室溫孵育20分鐘，PBS洗5遍，烘干；滴上封片液，只需蓋過涂有細(xì)胞的部分，蓋上蓋玻片，封片；

E、熒光顯微鏡下觀察被熒光抗體染上顏色的細(xì)胞，拍照，處理圖像。