[發明專利]一種人血清蛋白質電泳后同位素稀釋質譜定量方法

有效

• 申請號: 201410098779.5
• 申請日: 2014-03-18
• 公開（公告）號: CN103837593B
• 公開（公告）日: 2016-11-23
• 發明（設計）人: 馮流星;張丹;王軍;熊金平
• 申請（專利權）人: 中國計量科學研究院
• 主分類號: G01N27/62
• 分類號: G01N27/62;G01N1/38
• 代理公司: 北京思創畢升專利事務所 11218
• 代理人: 韋慶文

1.一種人血清蛋白質電泳后同位素稀釋質譜定量方法，其特征在于所述方法包括：非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離人血清中轉鐵蛋白、白蛋白；開發的“電泳后同位素稀釋方法”向蛋白條帶上加入富集同位素³⁴S稀釋劑；LA-ICP-MS檢測蛋白條帶中³²S⁺/³⁴S⁺比值，對人血清中轉鐵蛋白、白蛋白進行定量分析。

2.如權利要求1所述的人血清蛋白質電泳后同位素稀釋質譜定量方法，其特征在于所述方法包括：

(1)待測樣品的前處理：包括人血清蛋白標準物質(CRM)的重構，標準轉鐵蛋白、白蛋白樣品溶液的配制，及樣品(CRM、標準轉鐵蛋白溶液、正常人血清樣品)的Fe富集處理；

(2)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離待測樣品：采用垂直板微型凝膠電泳系統對待測樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳使用溶液中不含蛋白質變性劑，待測樣品不經變性處理。根據轉鐵蛋白、白蛋白標準品的電泳條帶位置確定CRM、正常人血清中的轉鐵蛋白、白蛋白位置；

(3)電泳后同位素稀釋：電泳、染色、脫色處理后，切取待測蛋白條帶，浸泡在25～50μg/g的富集同位素³⁴S稀釋劑中2～10min，取出轉移到甘油中浸泡2～5min，再將凝膠轉移到載玻片上，室溫過夜干燥，待測備用；

(4)LA-ICP-MS檢測：采用激光燒蝕儀LSX213，對待測蛋白條帶進行脈沖激光燒蝕進樣，產生的氣溶膠直接輸送到ICP炬管；ICP-MS采用Element2扇形磁場電感耦合等離子體質譜儀，對蛋白條帶上的³²S⁺、³⁴S⁺信號進行檢測，得到以燒蝕時間/s為橫坐標，硫元素信號強度/cps為縱坐標的譜圖；

(5)待測蛋白樣品的定量計算：

以已知濃度的轉鐵蛋白、白蛋白標準品作為樣品，根據同位素稀釋法公式得出m_z/m_y值(激光燒蝕氣溶膠中樣品和稀釋劑的質量比)，然后將轉鐵蛋白、白蛋白的m_z/m_y值分別應用到人血清中轉鐵蛋白、白蛋白的定量分析，結合LA-ICP-MS檢測的相應蛋白中³²S⁺/³⁴S⁺比值，再次利用同位素稀釋法公式計算得到人血清轉鐵蛋白、白蛋白中硫元素濃度，根據相應蛋白質中硫的化學計量比，即可計算出人血清中轉鐵蛋白、白蛋白的濃度。

3.根據權利要求2所述的人血清蛋白質電泳后同位素稀釋質譜定量方法，其特征在于：所述步驟(4)中激光燒蝕儀LSX213的工作條件為：激光能量2.0～4.0mJ/脈沖，掃描頻率10～20Hz，光斑尺寸100～200μm，掃描速度30～60μm/s，燒蝕方式：線掃描。

4.根據權利要求2所述的人血清蛋白質電泳后同位素稀釋質譜定量方法，其特征在于：所述步驟(4)中電感耦合等離子體質譜儀Element2的分辨率為4000，消除同量異位素¹⁶O₂⁺、多原子離子¹⁴N¹⁸O⁺等對³²S⁺的譜線干擾；工作條件為：功率1100～1400W，樣品氣流速0.90～1.20L/min，輔助氣流速1.00～1.40L/min，冷卻氣流速15～20L/min，掃描次數700×1。