[發(fā)明專(zhuān)利]α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選模型及篩選方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410098701.3
• 申請(qǐng)日: 2014-03-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103868867A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 嚴(yán)偉;劉春滟
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 四川師范大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N21/31
• 分類(lèi)號(hào): G01N21/31
• 代理公司: 四川君士達(dá)律師事務(wù)所 51216
• 代理人: 芶忠義

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明公開(kāi)一種α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選模型及篩選方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

糖尿病(Diabetes?mellitus，DM)是以持續(xù)高血糖為基本生化特征一種綜合病癥，主要系由體內(nèi)胰島素相對(duì)或絕對(duì)不足所引起糖代謝紊亂所致。糖尿病主要有兩種類(lèi)型：Ⅰ型糖尿病又稱(chēng)胰島素依賴(lài)型糖尿病（IDDM），約占糖尿病發(fā)病率的5%；Ⅱ型糖尿病又稱(chēng)非胰島素依賴(lài)型糖尿病（NIDDM），約占糖尿病發(fā)病率的95%。

目前臨床上常用的口服降血糖藥物主要有硫脲類(lèi)、雙胍類(lèi)、苯甲酸衍生物類(lèi)、葡萄糖苷酶抑制劑類(lèi)和噻唑烷二酮類(lèi)。葡萄糖苷酶抑制劑類(lèi)為第四類(lèi)治療糖尿病的藥物，藥物開(kāi)發(fā)目前主要是集中在對(duì)Ⅱ型糖尿病的治療研究上。現(xiàn)已上市的α-葡萄糖苷酶抑制劑有阿卡波糖、米格列醇（Miglitol）和伏格列波糖（倍欣Voglibose）三種，已成為治療Ⅱ型糖尿病的首選藥和Ⅰ型糖尿病的胰島素治療的輔助藥物。α-葡萄糖苷酶抑制劑是一類(lèi)以延緩腸道碳水化合物吸收而達(dá)到治療糖尿病的口服降糖藥物。其作用機(jī)制為：競(jìng)爭(zhēng)性抑制位于小腸的各種α-葡萄糖苷酶，使淀粉類(lèi)分解為葡萄糖的速度減慢，從而減緩腸道內(nèi)葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖。

α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選方法常用有兩大類(lèi)。第一類(lèi)是葡萄糖氧化法，即以蔗糖或麥芽糖為底物，通過(guò)葡萄糖的生成量測(cè)定α-葡萄糖苷酶抑制劑的抑制活性。例如，張冉等人在《應(yīng)用α-葡萄糖苷酶抑制劑高通量篩選模型篩選降血糖中藥》（張冉等，中國(guó)藥學(xué)雜志，2007(10)）中公開(kāi)一種α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選方法：應(yīng)用大鼠小腸上段提取的α-葡萄糖苷酶，以蔗糖作為底物，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)體系中葡萄糖的生成量來(lái)檢測(cè)α-葡萄糖苷酶的活性；通過(guò)優(yōu)化酶促反應(yīng)條件，建立檢測(cè)α-葡萄糖苷酶活性的比色測(cè)定法及其抑制劑體外篩選的方法，并對(duì)30味中藥共72個(gè)樣品進(jìn)行高通量篩選。然而，絕大多數(shù)人群食物中碳水化合物的主要形式是淀粉，并非蔗糖或麥芽糖。

第二類(lèi)是PNPG法，即以4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）為底物，在波長(zhǎng)400nm（或405nm）處測(cè)定在酶作用下釋放出的有顏色的物質(zhì)硝基酚（PNP）的量測(cè)定抑制劑的抑制活性。例如，專(zhuān)利CN101975829A公開(kāi)了一種α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選方法，分三步：(1)體外篩選模型的建立：建立α-葡萄糖苷酶和底物PNPG的體外反應(yīng)模型；(2)組分庫(kù)的建立：選取中藥，根據(jù)“相似相容”原理，按照極性由小到大，用多種(≥2種)溶劑對(duì)每味中藥進(jìn)行系統(tǒng)提取，采用這種方法，每味中藥獲得多個(gè)提取部位；(3)篩選：將中藥的各個(gè)提取部位配成一定濃度的溶液，加入到反應(yīng)模型中反應(yīng)并計(jì)算抑制率。該篩選方法簡(jiǎn)單合理，易于操作，最終篩選出對(duì)α-葡萄糖苷酶有顯著抑制效果的中藥和中藥組分。但是，用PNPG來(lái)代替人體從食物中獲得的糖類(lèi)，并據(jù)此來(lái)篩選抑制劑，得到的結(jié)論值得商榷，因?yàn)镻NPG根本不存于與人體的腸道環(huán)境。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選模型，以馬鈴薯淀粉為底物，α-葡萄糖苷酶與馬鈴薯淀粉底物的水解產(chǎn)物葡萄糖采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定其標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；其技術(shù)操作簡(jiǎn)單，成本相對(duì)低廉，篩選抑制劑的靈敏度更高。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選方法，其技術(shù)操作簡(jiǎn)單，成本相對(duì)低廉，篩選抑制劑的靈敏度更高。該方法所選底物更接近食物，抑制劑的篩選結(jié)果更具說(shuō)服力。

本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供一種α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選方法在天然產(chǎn)物提取物或中藥復(fù)方提取物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供一種α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選模型，包括

A.建立α-葡萄糖苷酶和馬鈴薯淀粉底物的體外反應(yīng)模型；

B.制作水解產(chǎn)物葡糖糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；

C.α-葡萄糖苷酶活性抑制率的測(cè)定。

馬鈴薯淀粉更接近人體從食物中獲得的糖類(lèi)，采用其篩選α-葡萄糖苷酶活性抑制劑，篩選結(jié)果更具說(shuō)服力。同時(shí)，馬鈴薯淀粉中不含有還原糖殘基，相比可溶性淀粉（含有微量的還原糖殘基）作為底物，其反應(yīng)結(jié)果更為準(zhǔn)確、靈敏。

較佳的，所述的α-葡萄糖苷酶為提取自根霉的III型α-葡萄糖苷酶，相比于提取自酵母的Ⅰ型α-葡萄糖苷酶更為經(jīng)濟(jì)。