[發明專利]ERβ啟動子熒光素酶報告基因的重組與藥物篩選應用

有效

• 申請號: 201410098446.2
• 申請日: 2014-03-17
• 公開（公告）號: CN103937834A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發明（設計）人: 李江;李曉菊;楊柳;趙超悅;賀璽;魏溦
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;C12Q1/02
• 代理公司: 長春市四環專利事務所(普通合伙) 22103
• 代理人: 郭耀輝

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及雌激素受體β(ERβ)啟動子熒光素酶報告基因重組、構建雌激素受體β啟動子細胞模型及篩選出能夠有效減緩牙周組織疾病的繼續發展，維持牙槽骨高度的雌激素替代藥物。?

背景技術

近年來，國內外的許多研究都已證實雌激素與骨組織代謝之間存在著密切的關系。在口腔醫學領域，應用雌激素來改善牙槽骨的吸收，維護牙周組織健康的相關研究越來越受到學者們的關注。?

目前人們已經認識到，雌激素在牙周疾病發生的病理過程及牙槽骨的吸收過程中都起著重要的調控作用。例如，孕期的女性由于體內雌激素水平的改變，使其牙周疾病的嚴重程度大于其他時期；絕經后婦女體內雌激素缺乏可影響體內的骨轉換過程，導致骨吸收大于骨形成，進一步引起全身骨質疏松。在口腔中主要表現為牙槽骨吸收加快，進而引起牙齒松動。?

雌激素主要通過雌激素受體α（ERα，estrogen?receptorα）和雌激素受體β（ERβ，estrogen?receptorβ）兩種受體介導來行使其功能，這兩種受體存在于哺乳動物的很多細胞中，在對細胞功能的行使中也起著重要的調控作用，研究發現，雌激素可通過ER直接作用于牙周組織并發揮其作用，并且許多已知的骨代謝相關因子都受到雌激素的調控。有研究表明，在牙周組織細胞中ERβ的表達強于ERα表達，其對骨代謝作用稍大于ERα。并且當ERα基因結構遭到破壞時，ERβ基因表達模式不會發生明顯變化，說明ERβ介導雌激素的作用部分，可能以一種不直接依賴于ERα的方式進行的基因調控。因此本發明開創性的采用構建ERβ啟動子熒光素酶報告基因重組質粒來進行牙周疾病及骨代謝方面的研究。?

牙周膜細胞是牙周膜內的主要成分，對牙周膜的形成有決定性的作用。牙周膜細胞具備多向分化及增殖的潛能。牙周膜細胞的增殖、分化除了可維持牙周組織的對牙齒的營養和支持功能外，還可進一步影響牙槽骨的成骨活性。并且牙周膜細胞內存在介導雌激素的ERβ受體，其在外源性雌激素的刺激下，可使牙周膜細胞的成骨作用增強。本發明將重組的ERβ啟動子重組質粒轉染至牙周膜細胞中，為后期有效要藥物的篩選提供了基礎。?

因為雌激素長期服用會引起機體內環境的代謝紊亂，有一定的副作用。因此選擇植物雌激素來替代雌激素治療疾病越來越受到人們的關注。植物雌激素是一種來源于植物當中，具有類黃酮結構，并具類雌激素功能的物質。在我國中醫藥理中，許多中藥中都含有植物雌激素成分。因此，篩選出能夠替代雌激素的有效中藥成分對指導臨床治療雌激素缺乏引起的牙?周組織疾病及減緩牙槽骨的吸收有著重要的意義。?

發明內容

由于雌激素缺乏后易引起的牙周組織疾病和牙槽骨吸收加快，進而導致牙齒過早的松動脫落。并且臨床上尚未發現解決此問題的有效方法。本發明主要基于此治療難點，通過構建ERβ啟動子熒光素酶報告基因，構建牙周膜細胞ERβ啟動子模型，篩選有效維持牙周營養及促進骨形成的中藥藥物成分。本發明對于開發治療牙周疾病及減緩牙槽骨吸收的藥物具有重要的應用價值。?

ERβ啟動子重組質粒構建及藥物篩選的過程包括以下步驟：?

第一步：目的片段的獲取?

應用primer?premier5.0引物設計軟件設計ERβ啟動子的引物，以人類基因組為模板進行PCR，得到從-1137至+116，全長1253bp的ERβ啟動子序列。?

這段啟動子的堿基序列為：?

第二步：克隆載體的構建?

將擴增得到的目的片段與pGEM-T?Easy載體連接，經轉化、提取等步驟得到重組質粒后,酶切鑒定。?

第三步：表達載體pGL2-ERβpromoter的構建?

將克隆質粒和pGL-2載體進行雙酶切后連接，經轉化、培養和提取，構建pGL2-ERβ?promoter重組質粒，酶切鑒定重組序列，并且通過測序進一步確定。?

第四步：牙周膜細胞（PDLCS?periodontal?ligament?cells）培養與鑒定?

牙周膜組織在孵育72h后進行首次換液，培養至第10d，細胞集落數量和面積明顯增加，集落與集落之間無明顯間隙，各個細胞集落擴大直至鋪滿培養瓶底面，細胞呈長梭形，排列成旋窩狀。角蛋白染色陰性，波形蛋白染色陽性表明原代細胞為來自中胚層的成纖維細胞，所獲取的細胞較純可用于后續實驗。?

第五步：藥物篩選的應用?