[發明專利]一種檢測人細小病毒B19的試劑盒和方法

有效

• 申請號: 201410098048.0
• 申請日: 2014-03-17
• 公開（公告）號: CN103820581A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 鄭朝共;許錟;容新宗;黃琰
• 申請（專利權）人: 成都蓉生藥業有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

技術領域

本發明涉及一種檢測人細小病毒B19的試劑盒，屬于生物技術領域。

背景技術

人細小病毒B19（Human?parvovirus?B19）是一種直徑約為18～26nm的無包膜單鏈DNA病毒，屬于細小病毒科紅病毒屬，可引起傳染性紅斑、急性關節炎，感染孕婦可造成胎兒水腫乃至胎兒死亡。一般通過呼吸道傳播，也可經輸血、血液制品以及血-胎途徑傳播。人細小病毒B19的直徑小而且無包膜，滅活和去除工作非常困難，因此，需要建立一種B19的檢測方法，有效檢測血液制品中是否含有B19，以提高血液制品的安全性。

目前，B19的檢測方法分為血清學、分子生物學和組織學檢測三大技術。其中，以ELISA為代表的血清學檢查和以PCR為代表的分子生物學檢測較為容易。但由于B19病毒不易體外培養，抗原制備也比較困難，導致B19的血清學檢測難以普遍應用。PCR檢測則不需要培養病毒，也不需要制備抗原，更容易推廣使用。

趙國強等，“熒光定量PCR檢測B19病毒方法的建立”，鄭州大學學報（醫學版）2005年5月第40卷第3期等文獻公開了采用QPCR特異檢測B19病毒的方法，然而，這些方法都需要采用探針進行檢測，以確保檢測方法的特異性和準確度，導致檢測成本太高。

需要尋找一種成本更為低廉的PCR檢測方法。

發明內容

為解決上述問題，本發明提供了一種新的PCR檢測人細小病毒B19的試劑盒和方法。

本發明檢測人細小病毒B19的試劑盒，包含核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1～2所示的引物對，擴增來自人細小病毒B19的基因。

所述試劑盒還包含陽性對照模板：含有核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3所示基因片段的DNA分子。

優選地，所述DNA分子是包含SEQ?ID?NO:3所示核苷酸序列的重組質粒。進一步優選地，所述重組質粒為重組PMD19-T質粒。

本發明還提供了一種檢測人細小病毒B19的方法，它包括如下步驟：

（1）模板制備：提取待檢樣本中的DNA；

（2）擴增：采用核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1～2所示的引物對，以步驟（1）提取的樣本DNA為模板，PCR擴增。

（3）結果檢測：對擴增結果進行檢測，即可。

其中，步驟（1）中，所述待檢樣本為血液制品。

其中，步驟（2）中，所述PCR擴增以含有核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3所示基因片段的DNA分子為陽性對照模板。

優選地，所述DNA分子是包含SEQ?ID?NO:3所示核苷酸序列的重組質粒。進一步優選地，所述重組質粒為重組PMD19-T質粒。

其中，所述的PCR為熒光定量PCR。

熒光定量PCR,是指在PCR反應體系中加入熒光結合物質或熒光標記的探針，利用熒光信號積累實時監測整個PCR過程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

本發明進一步提供了SEQ?ID?NO:1～2所示核苷酸序列的用途，其用于擴增或檢測來自人細小病毒B19的基因。

本發明通過設計特定的檢測引物，在不使用探針的情況下特異擴增B19的基因，同時，靈敏度高，重復性好，準確度高，可有效檢測血液制品中B19病毒的含量，具有良好的應用前景。

以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發明的上述內容做進一步地詳細說明。但不應理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發明權利要求書的內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。

附圖說明

圖1PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。1:DNA?maker，100bp遞增；2:B19DNA擴增產物；3:重組質粒擴增產物；4:陰性對照

圖2特異性擴增檢測曲線

圖3QPCR的熔解曲線；

圖4QPCR的標準曲線；

圖5樣品檢測結果與實際值之間的相關性。

具體實施方式

試驗材料：

1.病毒株

人細小病毒B19陽性血漿（成都蓉生藥業有限責任公司血源檢測中心保存）；豬細小病毒PPV（Porcine?parvovirus，ATCC，批號：2547326）；偽狂犬病毒PRV（Pseudorabies?virus，中國獸醫監察所，批號：198777）；牛細小病毒BPV（Bovine?parvovirus，成都生物制品研究所，批號：20111118）；鼠細小病毒MVM（Minute?virus?of?mice，ATCC，批號：58073406）。