[發(fā)明專利]一種制備動(dòng)物轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性單細(xì)胞克隆的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410097949.8
• 申請(qǐng)日: 2014-03-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103937746A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳珍芳;賀曉燕;張獻(xiàn)偉;李紫聰;劉德武;石俊松;周榮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/87;C12N5/073
• 代理公司: 廣州市深研專利事務(wù)所 44229
• 代理人: 陳雅平

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及動(dòng)物轉(zhuǎn)基因方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速可行的制備動(dòng)物轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性單細(xì)胞克隆的方法。

背景技術(shù)

近年來(lái)發(fā)展迅速的動(dòng)物轉(zhuǎn)基因和動(dòng)物體細(xì)胞克隆兩項(xiàng)技術(shù)對(duì)生物、農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)等諸領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用已產(chǎn)生了變革性的影響。已開(kāi)發(fā)用于動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的方法多種多樣，其中包括顯微注射法、精子載體法、逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)技術(shù)等。目前，在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因大家畜研究中應(yīng)用較多的是更為高效安全的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞核移植法。該方法是將外源基因轉(zhuǎn)移至體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，大片段外源基因的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率通常較低，需要利用熒光標(biāo)記和新霉素（neomycin，neo)等藥物標(biāo)記來(lái)篩選并擴(kuò)增基因組內(nèi)整合了外源目標(biāo)基因的細(xì)胞。之后利用這種轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性克隆細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植獲得的克隆動(dòng)物全部為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的獲得是轉(zhuǎn)基因細(xì)胞核移植技術(shù)的難點(diǎn)之一。目前國(guó)內(nèi)外的動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系篩選的通用方法是在基因轉(zhuǎn)染后進(jìn)行兩周左右的藥物篩選，未整合外源基因的絕大部分細(xì)胞由于缺乏抗性標(biāo)記基因而死亡。繼續(xù)使用濃度減半的藥物維持篩選和培養(yǎng)，之后刮除不表達(dá)熒光的耐藥性非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，用克隆環(huán)局部消化轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性細(xì)胞克隆并擴(kuò)增培養(yǎng)。由此方法獲得的單克隆細(xì)胞不一定是由單個(gè)細(xì)胞分裂增殖形成的，而很大可能是由相近位置的兩個(gè)或很多個(gè)轉(zhuǎn)染時(shí)整合了目標(biāo)基因的不同細(xì)胞增殖而來(lái)的。外源基因隨機(jī)整合入細(xì)胞基因組內(nèi)時(shí)，不同細(xì)胞內(nèi)的外源基因的插入位點(diǎn)不一樣，由這種單克隆細(xì)胞核移植后出生的不同轉(zhuǎn)基因動(dòng)物個(gè)體的外源基因整合在染色體上的位置和對(duì)自身其他基因表達(dá)的影響，目標(biāo)基因的表達(dá)水平及遺傳效應(yīng)都可能不一樣。因此轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的目標(biāo)基因的整合、表達(dá)鑒定、生物安全和篩選高表達(dá)優(yōu)良性狀個(gè)體的工作很繁重，檢測(cè)耗費(fèi)成本很高。

通過(guò)轉(zhuǎn)基因單細(xì)胞克隆方法才能獲得生物學(xué)性狀均一和外源基因表達(dá)模式一致的細(xì)胞群體。采用單細(xì)胞克隆核移植能大大簡(jiǎn)化所獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的檢測(cè)鑒定工作。目前，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低和藥物篩選后細(xì)胞克隆形成能力降低是難于獲得轉(zhuǎn)基因單細(xì)胞克隆的主要障礙。轉(zhuǎn)基因單細(xì)胞克隆的制備通常采用有限稀釋法。它是一種適用于一般細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞純化技術(shù)，其主要方案是計(jì)算細(xì)胞濃度后稀釋細(xì)胞，使細(xì)胞濃度達(dá)到0.01個(gè)/μL，將細(xì)胞接種至96孔板中，每孔100μL，理論上來(lái)說(shuō)有些孔內(nèi)有且只有一個(gè)細(xì)胞，這樣增殖分裂下去就能獲得單細(xì)胞克隆。

目前，運(yùn)用電穿孔或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等方法介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)移入細(xì)胞的效率仍然很低，特別是超過(guò)10kb的大片段外源基因整合效率大多低于5%。利用有限稀釋法接種轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞至96孔板中，雖然操作簡(jiǎn)單，對(duì)細(xì)胞的物理?yè)p害小，但此方法不能保證每孔都為單個(gè)細(xì)胞，且能從混雜細(xì)胞中挑選出轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性單細(xì)胞的概率非常小。G418是一種氨基糖苷類抗生素，對(duì)原核和真核等細(xì)胞都有毒性，是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的篩選藥物。當(dāng)外源新霉素抗性基因neo被整合入真核細(xì)胞基因組后，如果能啟動(dòng)其編碼的序列轉(zhuǎn)錄并高效表達(dá)G418抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，則能使細(xì)胞在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。若細(xì)胞經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的藥物篩選去除大部分非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞后再用有限稀釋法進(jìn)行單克隆化培養(yǎng)，由于非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞易出現(xiàn)耐藥性克隆團(tuán)，以及G418篩選對(duì)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性細(xì)胞的毒性較大等現(xiàn)象同樣會(huì)影響稀釋法獲得的目標(biāo)單細(xì)胞數(shù)量比例和單細(xì)胞的克隆形成能力。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問(wèn)題，提供一種快速高效制備動(dòng)物轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性單細(xì)胞克隆的方法。

本發(fā)明提供的制備方法，步驟如下：

（1）構(gòu)建包括目的基因、熒光標(biāo)記基因和藥物篩選標(biāo)記基因的質(zhì)粒；

（2）步驟（1）獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染已培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的宿主動(dòng)物細(xì)胞；

（3）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的宿主動(dòng)物細(xì)胞經(jīng)過(guò)生長(zhǎng)恢復(fù)后，進(jìn)行消化、離心和重懸稀釋，再置于熒光顯微鏡下，用內(nèi)徑20~80μm的吸針吸取表達(dá)熒光標(biāo)記基因的單個(gè)細(xì)胞，分別接種至不同份的細(xì)胞培養(yǎng)基中；

（4）各單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)成克隆團(tuán)后，消化其中穩(wěn)定表達(dá)熒光標(biāo)記基因的細(xì)胞克隆團(tuán)進(jìn)行傳代擴(kuò)增，即得到轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性單細(xì)胞的克隆。

優(yōu)選地，步驟（3）所述吸針為玻璃吸針，其制備方法包括：用無(wú)菌玻璃管在使其軟化的溫度下拉制成內(nèi)徑20~80μm的吸針，吸針口燒至平滑，另一端連接橡膠吸頭。

優(yōu)選地，步驟（3）所述細(xì)胞培養(yǎng)基由40%~65%體積濃度的DMEM、15%~20%體積濃度的胎牛血清、20%~40%體積濃度的條件培養(yǎng)基、促進(jìn)細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)因子和維持陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞生長(zhǎng)的劑量的篩選藥物組成；