[發明專利]馬鈴薯X病毒弱毒株系的篩選及在交叉保護中的應用

有效

• 申請號: 201410097908.9
• 申請日: 2014-03-17
• 公開（公告）號: CN103820400A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 李向東;叢倩倩;王瑩;郭兆奎;李現道
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12N7/04
• 分類號: C12N7/04;C12R1/94
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及植物病毒基因工程領域，具體地，本發明涉及馬鈴薯X病毒（Potato?virus?X,PVX）弱毒株系的篩選及其在交叉保護中的應用。

背景技術

病毒病是作物上的重要病害，給農業生產造成巨大損失。由于作物病毒病種類多，傳播途徑復雜，生產上沒有免疫或高抗病毒病的品種，市場上又沒有對病毒病特效的藥劑，因而病毒病的防治非常困難。

交叉保護是指植株受弱毒株系侵染后，免受后繼的病毒強毒株系侵染的現象，已經在許多作物病毒病的防治中取得了成功。限制交叉保護廣泛應用的關鍵因素是可用的弱毒株系太少。

馬鈴薯X病毒（PVX）屬于馬鈴薯X病毒屬（Potexvirus），主要侵染煙草、番茄、馬鈴薯等茄科作物，是這些作物上的主要病毒之一。PVX與馬鈴薯Y病毒屬病毒間有協生作用，一旦復合侵染會引起嚴重癥狀，造成更大損失。

目前，關于PVX株系劃分的研究較多，但是關于PVX弱毒株系中的研究很少。本發明通過定點突變技術，獲得了4個新的致病力顯著降低的PVX弱毒株系，攻毒實驗證明，弱毒株系E1001A可以有效控制PVX強毒株系的侵染。

發明內容

本發明提供了一種PVX弱毒株系的篩選及應用，以PVX的侵染性克隆為基礎，通過定點突變技術在PVX的基因中定點引入突變，明確了調控PVX致病力的氨基酸位點，獲得了致病力顯著下降的PVX弱毒突變體。通過測定弱毒株系對強毒株系的交叉保護效果，獲得了能有效保護植株免受PVX強毒株系侵染的弱毒株系。

本發明實施的具體技術方案是：

a.突變體的獲得：以自主構建的馬鈴薯X病毒的侵染性克隆為基礎，針對其聚合酶第46位、863位、968位和1001位氨基酸設計突變引物，利用QuickChange^TM定點突變試劑盒在這些位點引入突變。

b.弱毒株系的篩選：通過農桿菌浸潤法將a中獲得的突變體接種到寄主植物本氏煙，觀察這些突變體所致癥狀的變化，篩選致病力明顯降低的突變體。

c.交叉保護效果測定：在接種弱毒株系后10天和15天接種PVX強毒株系，觀察弱毒株系對強毒株系的交叉保護效果。

采用本發明所述的技術方案，可以獲得如下的技術效果：

1）獲得了4個致病力明顯降低的PVX弱毒株系。

2）弱毒株系E1001A可有效保護植株免受PVX強毒株系的侵染。

附圖說明

圖1為PVX強毒株系和弱毒突變體接種后第6天的癥狀；

圖2顯示PVX強毒株系和弱毒突變體接種后10天在煙草中的積累水平；

圖3顯示間隔期為10天時，不同弱毒株系在挑戰接種后15天對煙草植株的保護效果；

圖4為不同處理的煙草植株內病毒的積累水平。

具體實施方式

以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發明的上述內容做進一步的詳細說明，但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。

本發明所提供的實施例，均按照常規實驗條件，其中所采用的引物序列如下表：