[發明專利]一種催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的發酵方法

無效

• 申請號: 201410096647.9
• 申請日: 2014-03-17
• 公開（公告）號: CN103834600A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發明（設計）人: 孫安順
• 申請（專利權）人: 蔡建華
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P13/02;C12R1/40
• 代理公司: 大慶禹奧專利事務所 23208
• 代理人: 朱士文;楊曉梅

技術領域

本發明屬于工業微生物技術領域，具體涉及一種催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的發酵方法。

背景技術

丙烯酰胺是一種用途廣泛的有機化工原料，以它為單體合成的產品不下百種，其中以聚丙烯酰胺用途最廣。聚丙烯酰胺的主要用途是用于油田調整吸水剖面和“三次采油”中，近年來，為適應我國原油“三次采油”對超高分子量聚丙烯酰胺(相對分子質量≥2000萬)的需求，丙烯酰胺的生產將有較大的發展。

丙烯酰胺是以丙烯腈為原料水合而成，從20世紀50年代至今，生產工藝先后經歷了硫酸水合、銅系催化的化學水合及微生物腈水合酶生物轉化3個發展階段。1973年，法國研究者Galzy及其研究組發現了一種能催化丙烯腈水合停留在丙烯酰胺的微生物BrevbacteriumR312，從而開始了用微生物生產丙烯酰胺的研究。1985年，日本日東公司建成了世界上第一個微生物法生產丙烯酰胺的工業性裝置。上海農藥所也在1986年從泰山的土壤中找到了一株產腈水合酶的菌株，并開始了微生物法生產丙烯酰胺的研究。腈水合酶是一種可以把腈化合物的腈基進行水合后轉變為酰胺基，制造對應的酰胺化合物的微生物的酶，腈水合酶作為催化劑催化丙烯腈水合成丙烯酰胺的方法正成為主流。與銅系催化法相比，微生物法有許多優點：酶催化反應在常溫、常壓下進行，提高了生產安全性；丙烯腈的轉化率接近100%，不需回收未反應原料；由于省去了銅分離工段，產品中不含銅離子，產品純度高，特別適合生產超高分子量的聚丙烯酰胺；工藝過程簡單，設備投資少，生產經濟效益高。微生物法催化生產丙烯酰胺是石油化工骨干產品利用酶催化技術成功的第一范例，具有劃時代的意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的發酵方法，本發明的光敏性腈水合酶菌株是一種惡臭假單胞菌，經傳統發酵、催化合成丙烯酰胺，利用本發明菌株合成的丙烯酰胺水合產物濃度高，減少了濃縮的負擔，無副產物，產品純度高，適合工業化生產丙烯酰胺。

本發明所采用的技術方案是：一種催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的發酵方法。

一：催化劑制備

菌體發酵培養：將惡臭假單胞菌(Pseudomonas?putida)菌體接種于固體培養基，活化后挑取菌苔在搖床中發酵制備腈水合酶，經光照、溫度為30℃，搖床轉速200r·min^-1，培養96h后得到具有腈水合酶活力的發酵液，且發酵液的總酶活達800～1200萬單位/毫升發酵液；

固體培養基配方為：葡萄糖1%、酵母浸膏0.36%、K₂HPO₄?·3H₂O0.2?%、NaCl?0.1%、MgSO₄?·7H₂O?0.015%，瓊脂2%、余量為脫鹽水；

發酵培養基配方為：葡萄糖1～3%，酵母浸膏0.5～1%，谷氨酸0.05～0.1%，尿素0.5～1%，K₂HPO₄·3H₂O0.03～0.1%，KH₂PO₄0.03～0.1%，MgSO₄?·7H₂O?0.03～0.1%，Fe³⁺?0.0001～0.003%，pH值7.5～8.5，余量為脫鹽水；上述百分比為質量百分比。

上述發酵過程中添加的Fe³⁺為FeCl₃、Fe₂(SO₄)₃、Fe(NO)₃中的任意一種。

上述所述光照條件為培養階段可見光照射發酵液。

催化劑懸浮液制備：將發酵液在分離因素≥3000離心分離，去上清液，將細胞懸浮于脫鹽水中，配成菌體細胞與脫鹽水體積比為1：100～1:200的催化劑懸浮液備用。

含有光敏性腈水合酶菌株催化合成丙烯酰胺的方法包括如下步驟：向催化劑懸浮液中緩慢加入丙烯腈，常壓，溫度為30℃，200r·min^-1的攪拌速度下進行酶催化水合反應，丙烯腈的添加量占反應體系的20～30%（wt），經過一段時間的反應，獲得丙烯酰胺溶液；?