[發明專利]一種通過Notch通路調節胰腺癌細胞EGFR表達的方法

無效

• 申請號: 201410095644.3
• 申請日: 2014-03-17
• 公開（公告）號: CN103992987A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發明（設計）人: 張玉祥;劉浩
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/63;C12N15/113
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及通過Notch通路調節胰腺癌細胞EGFR表達的方法，屬于腫瘤分子生物學領域。?

背景技術

表皮生長因子受體(epithelial?growth?factor?receptor，EGFR)可啟動細胞核內的有關基因，從而促進細胞分裂增殖。目前已經發現在胃癌、乳腺癌、膀胱癌和頭頸部鱗癌中，EGFR表達增高，說明表皮生長因子受體是在許多腫瘤的發生發展中起關鍵作用。?

Notch信號通路是一個高度進化并且保守的通路，介導細胞和細胞之間的相互作用。當相鄰的細胞配體與受體相互作用時，會導致Notch蛋白連續裂解，釋放出受體的胞內段(NICD)。NICD轉入細胞核內，并在細胞核中與DNA結合蛋白CSL(CBFi／RBP-Jκ，Suppressor?of?Hairless，Lag-1的首字母縮寫)結合，啟動目標基因的轉錄。我們的研究證明EGFR的表達受Notch-1的調控，通過調控Notch-1可以降低EGFR的表達。?

發明內容

本發明要解決的技術問題是為控制腫瘤細胞的增殖與生長，如何阻斷EGFR所介導的信號通路。?

本發明的技術解決方案為使用Notch1siRNA來干擾胰腺癌細胞后，可使EGFR表達明顯下降。?

本方法具有如下的優點和效果：?

1.本方法可使EGFR表達明顯下降。?

2.本方法，具有穩定性好，作用明顯的特點。?

附圖說明

圖1ChIP樣品驗證的PCR電泳結果(M：100bp?DNA?Marker；1：用RNA?pol?II抗體做的陽性對照組；2：Flag抗體沉淀Notch1的樣品組；3：Flag抗體沉淀CSL的樣品組；4：非特異性IgG抗體做的陰性對照組)；?

圖2測序片段中CSL結合位點示意圖(在我們所測序片段之中比對CSL結合位點后，我們發現了有兩處是和CSL結合位點序列一致的)。?

具體實施方式

1.合成干擾片段?

合成特異性針對Notch1基因mRNA的siRNA和陰性對照siRNA。?

2.轉染?

在含有10％的胎牛血清的1640培養基中培養BxPC3細胞，在細胞培養箱中于37℃、50mL／L?C02飽和濕度下培養，試驗組轉染第一步中所獲得重組表達載體質粒，對照組轉染pcDNA3空質粒。細胞提前24小時傳代，六孔板中融合度至80％左右后，即按照Lipofectamine^TM2000說明書進行陰性對照siRNA序列和Notch1?siRNA的轉染。?

3.WESTERN?BLOT檢測?

在上述胰腺癌細胞中加入RIPA蛋白裂解液裂解細胞后，我們按照試劑盒要求提取總蛋白，制作聚丙烯酰胺濃縮膠和分離膠，取不同組別的等量蛋白樣品進行電泳，然后依次進行轉膜、封閉、一抗、二抗孵育和洗滌(其中一抗稀釋濃度為：1∶500；二抗稀釋濃度為：1∶3000)。最后，顯色曝光并通過x線膠片曝光洗片，經自動電泳凝膠分析系統掃描井測定各組蛋白條帶的灰度值進行比較，EGFR表達下降。?

4.染色質免疫沉淀實驗?

(1)所培養BxPC3細胞的匯合度為80％時(每盤約1×10⁷個，用RPMI1640培養基)，開始準備實驗。?

(2)用Roche公司的轉染試劑將5種質粒分別轉染進BxPC3細胞中，每種質粒至少轉染2盤細胞，37度恒溫箱培養48h后收獲細胞。?

(3)在試驗開始前一天將蛋白G瓊脂糖球珠的封閉處理：取300μL溶脹好的蛋白G瓊脂糖球珠，短暫離心后棄上清，加入1mL雙蒸水，在混勻器上4℃旋轉3min洗去殘留的鹽和乙醇，重復洗3次。加入雙蒸水900μL、10mg／mL?BSA100μL，在混勻器上4℃旋轉孵育過夜，備用。?

(4)向培養基中加入4％甲醛溶液，使其終濃度為1％，混勻后在室溫下靜置交聯10分鐘。再加入1.25M甘氨酸，使其終濃度為0.125M，混勻后在室溫下靜置5分鐘終止交聯反應。倒掉反應液，將培養皿至于冰上。?

(5)用適量4℃1×PBS將每盤細胞洗2次，吸干洗液。之后每盤加1.2mL4℃1×PBS，用細胞刮刮下細胞，移至1.5mL?EP管中。4℃5000rpm離心5min，棄上清，得到細胞沉淀。?