[發明專利]自體血清抗原致敏DC?CIK細胞的制備方法

有效

• 申請號: 201410095323.3
• 申請日: 2014-03-17
• 公開（公告）號: CN103981144B
• 公開（公告）日: 2017-06-06
• 發明（設計）人: 黃浩;鄒暢
• 申請（專利權）人: 深圳市合一康生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;A61P35/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.自體血清抗原致敏DC-CIK細胞的制備方法，包括以下步驟：

A）自體血清抗原的制備；

B）外周血單個核細胞的制備；

C）DC的分離和培養；

D）CIK細胞的誘導擴增；

E）DC與CIK細胞共培養制備DC-CIK細胞；

所述的A）步驟為取外周血50-100ml，離心分離患者血清，加入終濃度為0.1-1.0mg/ml的亮抑蛋白酶抑制劑進行蛋白濃縮，隨后用無菌離心管存儲，置于-20℃以下環境冷凍24-48h，取出后在0-4℃環境中放置10-16h，吸取上層血漿部分并棄去；56℃滅活補體成分20-30min，微孔濾膜過濾，得到自體血清腫瘤抗原；

所述步驟C）為依據腫瘤標志物測定結果，在細胞貼壁后加入終濃度為5-20%的步驟A）制備得到的自體血清抗原進行DC致敏，在培養第6至第7天加入終濃度為200-1000ng/ml的腫瘤壞死因子，得到自身抗原致敏后的DC。

2.如權利要求1所述的自體血清抗原致敏DC-CIK細胞的制備方法，其特征是：所述分離血清后蛋白濃縮后的蛋白處理條件為-20℃冷凍48h，隨后在4℃環境中豎直放置16h；所述滅活條件為56℃滅活補體成分30min；所述微孔濾膜為孔徑為22μm及以下微孔濾膜。

3.如權利要求1所述的自體血清抗原致敏DC-CIK細胞的制備方法，其特征是：所述的B）步驟為采用密度梯度離心法分離獲得外周血單個核細胞（PBMC）；采用AIM-V無血清培養基懸浮分離的PBMC，按照0.5-1×10⁸/瓶的數量置于培養瓶中，細胞培養箱中靜置1-3h，吸取未貼壁淋巴細胞用于CIK細胞的培養；貼壁細胞用于DC的培養。

4.如權利要求1所述的自體血清抗原致敏DC-CIK細胞的制備方法，其特征是：所述的E）步驟為將上述抗原致敏后的DC與前述CIK細胞混合培養5-8天，收獲自體抗原致敏DC-CIK細胞。

5.如權利要求1-4任一項所述的自體血清抗原致敏DC-CIK細胞的制備方法，其特征是：所述DC-CIK細胞的細胞組成為CD3⁺細胞占90%以上，其中CD3⁺CD4⁺細胞在10-20%，CD3⁺CD8⁺細胞在60-80%，CD3⁺CD56⁺細胞在10-20%。