[發(fā)明專利]針對(duì)于載脂蛋白A1的單域抗體及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410095206.7
• 申請(qǐng)日: 2014-03-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103833851A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 萬(wàn)亞坤;孫燕燕;李光輝;母亞雯
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東南大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K16/18
• 分類號(hào): C07K16/18;C12N15/13;C12N15/63;G01N33/68
• 代理公司: 江蘇永衡昭輝律師事務(wù)所 32250
• 代理人: 王斌

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)或生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及針對(duì)于載脂蛋白A1的單域抗體。

背景技術(shù)

載脂蛋白在脂蛋白代謝中具有重要的生理功能。載脂蛋白主要分A、B、C、D、E五類，主要在肝(部分在小腸)合成，是構(gòu)成血漿脂蛋白的重要組分。載脂蛋白A1水平受性別、種族、年齡、體質(zhì)指數(shù)、酒精攝入量、激素、吸煙等因素影響。研究結(jié)果顯示載脂蛋白A1可以結(jié)合周圍組織游離膽固醇，促進(jìn)動(dòng)脈壁細(xì)胞中膽固醇的清除，加速肝臟內(nèi)膽固醇代謝。所以，載脂蛋白A與高密度脂蛋白的臨床意義相同，它與冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化呈負(fù)相關(guān)，即它升高有利于預(yù)防冠心病；而降低可出現(xiàn)低高密度脂蛋白血癥，易誘發(fā)動(dòng)脈硬化和冠心病。

對(duì)于ApoA1的測(cè)定，現(xiàn)廣泛采用免疫透射比濁法；此法簡(jiǎn)便快速，便于大批量樣本測(cè)定，而這種檢測(cè)方法是基于將載脂蛋白A1免疫綿羊獲得的多抗來(lái)實(shí)現(xiàn)的。但是這種傳統(tǒng)意義上的抗體穩(wěn)定性差、靈敏度低、生產(chǎn)成本高，所有因素均限制了對(duì)于載脂蛋白A1的檢測(cè)。1993年比利時(shí)科學(xué)家首次在Nature報(bào)道：在駱駝血液中的抗體，有一半沒(méi)有輕鏈，而且更讓人驚喜的是，這些缺失輕鏈的“重鏈抗體”能像正常抗體一樣與抗原等靶標(biāo)緊密結(jié)合，另外不像scFv那樣互相沾粘，甚至聚集成塊。這種抗體只包含一個(gè)重鏈可變區(qū)和兩個(gè)常規(guī)的CH2與CH3區(qū)，更重要的是單獨(dú)克隆并表達(dá)出來(lái)的VHH區(qū)具有很好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與抗原結(jié)合活性，分子量只是普通抗體的1/10，所以VHH也稱Nanobody（單域抗體）；與此同時(shí)單域抗體化學(xué)性質(zhì)也更加靈活，穩(wěn)定性好，可溶性高，表達(dá)容易且利用微生物即可大量的獲得，容易偶聯(lián)其他分子，因此應(yīng)用單域抗體為研發(fā)載脂蛋白A1檢測(cè)試劑具有廣闊的前景。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供針對(duì)載脂蛋白A1的單域抗體，同時(shí)提供該單域抗體的編碼序列及該單域抗體在制備檢測(cè)的應(yīng)用。

技術(shù)方案：為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的第一方面，提供了一種載脂蛋白A1的單域抗體，包括框架區(qū)FR和互補(bǔ)決定區(qū)CDR，所述框架區(qū)FR選自下組的FR的氨基酸序列中任意一種：SEQ?ID?NO：1所示的FR1，SEQ?ID?NO：2所示的FR2，SEQ?ID?NO：3所示的FR3，SEQ?ID?NO：4所示的FR4；或SEQ?ID?NO：5所示的FR1，SEQ?ID?NO：6所示的FR2，SEQ?ID?NO：7所示的FR3，SEQ?ID?NO：8所示的FR4；

所述互補(bǔ)決定區(qū)CDR選自下組的CDR的氨基酸序列中任意一種：

SEQ?ID?NO：9所示的CDR1，SEQ?ID?NO：10所示的CDR2，SEQ?ID?NO：11所示的CDR3；或SEQ?ID?NO：12所示的CDR1，SEQ?ID?NO：13所示的CDR2，SEQ?ID?NO：14所示的CDR3；

優(yōu)選地，所述的載脂蛋白A1的單域抗體的VHH鏈，它具有SEQ?ID?NO：15和SEQ?ID?NO：16所示的氨基酸序列。

本發(fā)明第二方面，一種載脂蛋白A1單域抗體，它針對(duì)載脂蛋白A1表位的單域抗體，包括兩條具有SEQ?ID?NO：15和SEQ?ID?NO：16所示氨基酸序列的VHH鏈。

本發(fā)明第三方面，提供了一種DNA分子，它編碼選自下組的蛋白質(zhì)：本發(fā)明所述的載脂蛋白A1的單域抗體的VHH鏈，或本發(fā)明所述的載脂蛋白A1單域抗體。

優(yōu)選地，所述的DNA分子，其特征在于，它具有選自下組的DNA序列：

SEQ?ID?NO：17和SEQ?ID?NO：18

本發(fā)明的第四方面，提供了一種表達(dá)載體，它含SEQ?ID?NO：17和SEQ?ID?NO：18所示的核苷酸序列。

本發(fā)明的第五方面，提供了一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有所述的表達(dá)載體。

本發(fā)明的第六方面，提供了本發(fā)明所述的載脂蛋白A1單域抗體用于檢測(cè)載脂蛋白A1的用途。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下：本發(fā)明將血液中提取的載脂蛋白A1免疫新疆單峰駝，隨后利用該駱駝外周血淋巴細(xì)胞建立了針對(duì)于載脂蛋白A1的單域抗體基因庫(kù)，試驗(yàn)中將載脂蛋白A1偶聯(lián)在酶標(biāo)板上，以此形式的抗原利用噬菌體展示技術(shù)篩選免疫性的單域抗體基因庫(kù)（駱駝重鏈抗體噬菌體展示基因庫(kù)），從而獲得了針對(duì)載脂蛋白A1特異性的單域抗體基因，將此基因轉(zhuǎn)至大腸桿菌中，從而建立了能在大腸桿菌中高效表達(dá)的單域抗體株。

附圖說(shuō)明

圖1是單域抗體的基因電泳圖；其中泳道1是DNA分子標(biāo)準(zhǔn)，泳道2是PCR擴(kuò)增重鏈抗體可變區(qū)片段。

圖2是構(gòu)建單域抗體的噬菌體展示文庫(kù)時(shí)，文庫(kù)庫(kù)容測(cè)定圖。