[發明專利]一種小尺寸金納米顆粒囊泡結構的基因載體及其制備方法

在審

• 申請號: 201410095155.8
• 申請日: 2014-03-11
• 公開（公告）號: CN104127875A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發明（設計）人: 劉遵峰;姜楠
• 申請（專利權）人: 常州碳宇納米科技有限公司
• 主分類號: A61K47/02
• 分類號: A61K47/02;A61K47/18;A61K48/00
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域：

本發明涉及一種新型基因轉染載體——小尺寸金納米顆粒囊泡及其制備方法，屬生物醫學工程領域。?

背景技術：

基因轉染是指將具有生物功能的核酸轉移或運送到細胞內并使核酸在細胞內維持其生物功能。然而由于游離態的DNA分子容易被血清中的核苷酸酶降解，且很難穿過細胞間間質和細胞膜進入細胞，因此基因轉染需要一定的轉染試劑將帶有目的基因的載體運送到細胞內，近年來開發高效安全的基因載體成為研究重點。?

傳統基因傳遞系統中載體可分為兩大類：一類是病毒載體，一類是非病毒載體。早期的病毒載體具有一定的自身缺陷，如免疫原性、生物安全性、難以大規模生產等不容忽略的問題，因而非病毒基因轉染載體近年來引起廣泛關注，并有望取代病毒類載體作用于今后的基因治療研究。尤其是隨著納米技術的飛速發展，近年來納米粒子生物轉運載體因其簡便的制備方法、較低的細胞毒性以及對各種物理化學刺激的響應能力等優勢日益成為熱點研究領域，各種表面功能化的納米粒子已經成功應用于基因、藥物和蛋白質轉運，并取得了重要研究成果。其中金納米顆粒具有其獨特的優勢：合成簡便、操作容易、易于修飾、化學反應惰性以及良好的生物相容性等，并在基因載體方面受到了廣泛地關注。金納米粒子表面既可以與氨基發生非共價的靜電吸附，又可以與巰基形成很強的共價鍵，是一種理想的基因轉染載體材料。?

微納米囊泡是生物醫藥研究領域的熱點研究材料之一，這種功能性可廣泛應用與生物催化、生物診斷、微型反應器構建和藥物運轉等研究領域。以納米粒子作為囊壁，可將納米粒子獨特的物理化學性質整合到微囊中，通過對納米粒子材料、尺寸、表面性質和自組裝條件進行優化，可對微囊的物理化學性質，如機械強度、滲透性和表面化學性質等進行調控，得到集多種功能于一體的新型囊泡結構。在基因轉載過程中載體的尺寸是至關重要的，載體的尺寸將決定其對內皮細胞灌輸和對材料擴散傳輸的難易，通常來說，尺寸越小效率越高。但由于納米粒子難以克服納米級乳滴的界面能和拉普拉斯壓力差，目前的方法只能自組裝粒徑為微米級的微囊，較大的尺寸限制了該類型微囊在細胞運轉中的應用。?

因此獲得小尺寸的納米顆粒囊泡結構以作為基因轉染載體仍然是當前基因轉染研究領域的重要方向。?

發明內容：

1.本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種小尺寸金納米顆粒囊泡結構的基因載體及其制備方法。?

2.小尺寸金納米粒子囊泡式結構及其形成的基因載體是一種金納米顆粒的囊泡結構，由三部分組成，包括：金納米顆粒，油相，和陽離子配體，其中陽離子配體包括精氨酸、賴氨酸、組氨酸或者以上幾種組成的陽離子多肽配體，所說的陽離子配體連接到金納米顆粒上。所述的陽離子多肽配體包括KKK、KRK、HKRK。所述的金納米顆粒囊泡結構平均尺寸小于150納米。?

3.下面給出本發明所述的小尺寸納米金顆粒囊泡結構基因載體的原理。本發明針對當前基因轉染試劑存在的問題，提出了如下解決方案。該金納米顆粒囊泡式基因載體所使用的金納米顆粒(AuNPs)具有較低的細胞毒性，作為基因載體將產生較小毒性；以亞油酸為油相制備自組裝所需的納米級乳滴模板，并在乳化的同時加入少量的上述乳滴模板，利用球磨原理縮小乳滴尺寸；納米囊泡尺寸小于150納米，能順利進入細胞，并同時提高轉染效率；在加入乳滴模板后進行自組裝時，表面帶有正電荷且含有氨基類集團的AuNPs與乳滴中亞油酸的羧基形成的靜電吸附與氫鍵吸附等，在這類超分子作用力的驅動下，AuNPs可穩定的吸附在乳滴表面，形成囊泡穩定地分散在水中；使用陽離子配體修飾AuNPs，有利于通過正負電荷相互靜電吸引作用將帶有負電荷的基因進行負載；其形成的AuNPs-基因復合物帶有陽離子性質，有利于細胞對其進行攝取。因此該小尺寸金納米粒子囊泡結構基因轉染體系較傳統的基因轉染體系有較大的改進。?

該金納米囊泡結構基因轉染載體的制備方法，包括以下步驟(1)和步驟(3)，或步驟(2)和步驟(3)：?

(1)首先取10mg?AuNPs，溶解于10mL蒸餾后的DCM中，通氮氣10min以除去氧氣，向該溶液中加入30mg如權利要求1所述的氨基酸類陽離子配體，通氮氣5min后密閉，于室溫攪拌48h，旋轉蒸發洗滌后，在半透膜中滲透12h，最后分散于蒸餾水中。?

(2)取10mg?AuNPs，溶解于10mL蒸餾后的二氯甲烷中，通氮氣10min以除去氧氣，向該溶液中加入30mg如權利要求1所述的陽離子多肽配體，通氮氣5min后密閉，于室溫攪拌48h，旋轉蒸發洗滌后，在半透膜中滲透12h，最后分散于蒸餾水中。?