[發明專利]一種尿液中3-烷化腺嘌呤DNA加合物的測定方法

有效

• 申請號: 201410093890.5
• 申請日: 2014-03-14
• 公開（公告）號: CN103808836A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 田永峰;楊進;侯宏衛;胡清源;王安;劉勇;陳歡;劉彤;韓書磊;吳帥賓
• 申請（專利權）人: 國家煙草質量監督檢驗中心;中國科學院合肥物質科學研究院
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/02
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司 41110
• 代理人: 姜振東

1.?一種尿液中3-烷化腺嘌呤DNA加合物的測定方法，即3-甲基腺嘌呤（3-MeA）、3-乙基腺嘌呤（3-EtA）和3-羥乙基腺嘌呤（3-HOEtA）的測定方法，其特征在于：包括以下具體步驟：

a、樣品前處理：尿液在室溫狀態下解凍并混合均勻，取4?mL尿液，加入4mL超純水，加入100?μL混合內標，用水浴鍋調節溫度到75-85℃，取超純水稀釋至8?mL后的尿液置于固相萃取柱中；

固相萃取用Waters?Oasis?MCX固相萃取柱，預先用2?mL甲醇、5?mL水溶液活化，上樣量為8?mL，用2?mL?10％甲醇/水溶液淋洗，然后用1?mL乙酸乙酯淋洗，最后用甲醇/乙酸乙酯/氨水混合液洗脫，收集洗脫液并于60?℃下用氮氣吹至干，然后用100?μL水溶液溶解，供LC-MS/MS分離分析；

b、標準工作液的配制：用乙腈配制不同濃度的3-甲基腺嘌呤(3-MeA)標準工作溶液、3-乙基腺嘌呤（3-EtA）標準工作溶液和3-羥乙基腺嘌呤（3-HOEtA）標準工作溶液；

c、液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）測定，吸取配制好的不同濃度的3-甲基腺嘌呤(3-MeA)標準工作溶液、3-乙基腺嘌呤（3-EtA）標準工作溶液和3-羥乙基腺嘌呤（3-HOEtA）標準工作溶液，注入LC-MS/MS系統，得到線性回歸方程，對樣品待測液進行測定，測得分析物與內標峰面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測液中分析物的含量。

2.根據權利要求1所述的尿液中3-烷化腺嘌呤DNA加合物的測定方法，其特征在于：所述混合內標為d₃-3-MeA和?d₅-3-EtA混合溶液，其中d₃-3-MeA為100?ng/ml,?d₅-3-EtA為2ng/ml。

3.根據權利要求1所述的尿液中3-烷化腺嘌呤DNA加合物的測定方法，其特征在于：所述甲醇/乙酸乙酯/氨水混合液的具體配比為47.5:?47.5:?5。

4.根據權利要求1所述的尿液中3-烷化腺嘌呤DNA加合物的測定方法，其特征在于：在c步驟中，選取了Waters?HILIC色譜柱，規格150?mm?x?2.1?mm，2.5?μm，流動相體系選取A:乙腈和B:?10m?mol/L甲酸銨/水溶液，A:B為95:5。

5.根據權利要求4所述的尿液中3-烷化腺嘌呤DNA加合物的測定方法，其特征在于：色譜測定中的洗脫條件：流動相A:乙腈和B:?10m?mol/L甲酸銨/水溶液，A:B為95:5；流速0.25?mL/min；柱溫25?°C；進樣量3?μL，洗脫時間：0?~?20?min。

6.根據權利要求1所述的尿液中3-烷化腺嘌呤DNA加合物的測定方法，其特征在于：質譜條件：電噴霧離子源，正離子掃描方式；噴霧電壓為5500?V；霧化氣壓力為344.5?kPa；氣簾氣壓力為206.7?kPa；輔助霧化氣壓力為310.0?kPa；離子源溫度為500℃；去蔟電壓為100?eV；碰撞能為30?eV；駐留時間為100?ms，監測離子對為3-MeA：150→123定量離子對，150→108定性離子對；內標d₃-3-MeA為153→126；3-EtA：164→136定量離子對，164→119定性離子對；內標d5-3-EtA為169→137；3-HOEtA：180→136定量離子對，180→119定性離子對；內標d₅-3-EtA為169→137。