[發明專利]一株類芽孢桿菌及其用于κ-卡拉膠酶的制備方法

有效

• 申請號: 201410093127.2
• 申請日: 2014-03-14
• 公開（公告）號: CN103923853A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發明（設計）人: 張龍濤;郭娟娟;曾紹校;鄭寶東;張怡;歐洋;黃旭輝
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/42;C12R1/01
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

???本發明屬于生物化工領域，涉及一株類芽孢桿菌及其用于κ-卡拉膠酶的制備方法。?

背景技術

??卡拉膠是由1,3-β-D-吡喃半乳糖和1,4-α-D-吡喃半乳糖作為基本骨架,交替連接而成的硫酸線性多糖,主要存在于紅藻綱中的麒麟菜屬、角叉菜屬、杉藻屬和沙菜屬等的細胞壁中。根據其二糖單元上所含的硫酸基團的數量和內醚環的有無,可將卡拉膠分為κ-、ι-、γ-、λ-、ξ-、ω-和ν-卡拉膠等類型,工業生產和使用的主要為κ-卡拉膠、ι-卡拉膠和λ-卡拉膠3種。?

??卡拉膠是一種海藻硫酸半乳勻多糖，通過化學或生物手段降解和修飾后，獲得的半乳低聚糖硫酸醋及其衍生物具有多種生物活性如抗病毒、抗腫瘤、抗凝血等，對人體的細胞免疫和體液免疫功能也具有顯著的增強作用。研究顯示，卡拉膠及其低聚糖的生物學活性與分子量大小和硫酸根含量密切相關，一般認為，多糖分子量在5000-60000范圍具有明顯的生物活性，因此經降解后得到的卡拉膠低聚糖硫酸酷有可能成為新型海洋藥物的重要來源。?

卡拉膠酶主要來源于假單胞菌Paenibacillus、噬纖維菌Cytophaga、弧菌Vibrio、別單胞菌Alteromonas等。目前利用卡拉膠制備半乳低聚糖硫酸醋的方法主要依賴于化學法。由于化學降解方法存在反應條件不易控制、降解產率低、目的產物不易分離等無法克服的缺點，而酶解法可以最大程度地保護反應底物的活性基團不會在降解過程中受到破壞，從而為藥源開發奠定了良好的基礎。因此，通過從海藻物質或海洋生物中篩選可以產生卡拉膠酶的細菌成為了國內外的科技工作者的主要方向。?

用微生物法獲得卡拉膠酶的研究已經有30余年的研究歷史，但迄今為止，僅有為數不多的幾種微生物被發現具有生物法制備卡拉膠酶的功能，包括Pseudomonas?carrageenovora(MeLean?M?W?et.Journal?of?Biotechnology,1979)、Cytophaga?sp.lk一C783(Sarwar?G?et.Journal?of?Biotechnology,1987)、Delesseria?sanguinea（Potin?P?et.Biotechnology?and?Bioengineering?,1991）、Pseudoalteromonas?carrageenovora?(Miehel?G?et.Journal?of?Fermentation?and?Bioengineering,1999)、Pseudoalteromonas?porphyrae(劉光磊?et.海洋微生物多糖水解酶的基因克隆和高效表達，2012)等。因此篩選新的微生物菌種進行酶解法降解卡拉膠成為研究者的新任務。?

發明內容

??本發明的目的是提供一株能高效降解κ-卡拉膠的菌株并用其制備κ-卡拉膠酶的方法。?

??本發明的技術方案：一株篩選自角叉菜的細菌，可用于生產κ-卡拉膠降解酶，其命名為類芽孢桿菌（Paenibacillus?sp.）fjfst-333，已于2013年12月25日在中國典型培養物保藏中心登記保藏，其保藏號為CCTCC?NO:?M?2013707，保藏地址為武漢大學。?

??微生物菌株的篩選及鑒定：?

本發明從角叉菜進行卡拉膠降解菌的篩選。將角叉菜剪碎用海水（3%海鹽配置）浸泡2d，取上清液加入富集培養基中5℃，160r/min搖床培養3d后，重復操作3次，取0.1ml富集培養也涂布初篩分離培養基28℃倒置培養48h，挑取周圍形成明顯透明圈和凹坑的菌落劃線初篩培養基，培養48h后，挑取單菌落移接傳代培養基斜面，獲得卡拉膠降解菌純培養。純種接到發酵培養液種32℃，160r/min培養2d后檢測培養液中κ-卡拉膠酶的活力，最終篩選出目標菌株B-333對其進行生理生化鑒定和16s?rDNA序列分析，確定其為類芽孢桿菌（Paenibacillus?sp.），擬命名為類芽孢桿菌（Paenibacillus?sp.）fjfst-333。

??用所述的類芽孢桿菌（Paenibacillus?sp.）fjfst-333生產κ-卡拉膠酶的方法步驟如下：?