[發明專利]花生幾丁質酶基因啟動子及其應用

有效

• 申請號: 201410092152.9
• 申請日: 2014-03-13
• 公開（公告）號: CN103820456A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 喬利仙;陳新利;宋汝濤;隋炯明;王晶珊
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/84
• 代理公司: 青島聯智專利商標事務所有限公司 37101
• 代理人: 王曉曉

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及花生幾丁質酶基因啟動子及其應用。

背景技術

花生在生產過程中易感染多種病害，如網斑病、褐斑病、黑斑病、銹病、青枯病等，嚴重影響其品質和產量，花生種質資源中缺乏對這些病害高抗或免疫的抗源。利用基因工程技術將相關抗性基因導入花生，通過過量表達外源基因使植物抵御病原菌的侵襲，是當今提高花生抗病性的有效策略。植物受病原菌侵染會誘導產生多種防衛反應，尤其是產生各種水解酶及病程相關蛋白（PR蛋白），幾丁質酶是PR蛋白中重要的水解酶，在植物抵御真菌性病害的防衛反應中發揮著重要作用。同時該酶受到病菌真菌（Phoma?arachidicola）及激發子水楊酸分子（Salicylic?acid,SA）等的誘導表達。

啟動子是一段位于結構基因5'端上游的DNA序列，具有RNA聚合酶及相關轉錄因子的特異結合位點，它作為轉錄水平上一種重要的調控元件，是決定外源基因在轉基因植物中表達的關鍵。真核基因的表達調控十分復雜，其中轉錄水平的調控最為重要，分析轉錄起始水平調控的基本出發點是鑒定基因上游啟動子及研究啟動子中順式作用元件的特性，啟動子中這些特異結合位點的鑒定是研究啟動子驅動活性必不可少的工作。目前植物基因工程中常用的啟動子如花椰菜花葉病毒35S（CaMV35S）啟動子、水稻肌動蛋白基因（Actin1）啟動子等都屬于組成型啟動子，在這些啟動子驅動下的外源基因在轉基因植物的所有部位和發育階段均做同等水平的表達，這種外源基因的持續表達可能造成植物能量的損失，影響植物的生長發育，使毒性物質在植物體內積累。而誘導型啟動子能控制基因在特定時期、特定部位表達，這既避免了目的基因在組成型啟動子驅動下在寄主細胞內高表達對寄主細胞生長的影響，又可使寄主細胞對特定的環境信號作出反應，因此發掘和利用誘導型啟動子是使抗病基因有效利用的一種重要手段。目前已從多種植物中分離到病原物誘導啟動子，這類啟動子原來大多數屬于植物防衛反應基因上游的調控序列。如來自野生煙草的β-1,3-葡聚糖苷酶基因啟動子，可受丁香假單胞菌（Pseudomonas?syringae）、歐文氏菌（Erwinia?carotovora）誘導表達。擬南芥中可受立枯絲核菌（Rhizoctonia?solani）誘導的酸性幾丁質酶基因啟動子，在轉基因番茄中同樣能受番茄早疫病菌（Alternaria?solani）的誘導表達，馬鈴薯滲透調節蛋白（Osmotin）啟動子可受化學誘導物及馬鈴薯晚疫病菌（Phytophthora?infestans）等多種因子誘導表達。激發子作為病原菌及植物相互識別的重要信號分子，能誘導植物的廣譜抗性，可用于替代病原菌來研究誘導型啟動子。而不同基因啟動子存在著誘導驅動活性的差別，對外界環境的誘導反應有所不同，啟動子內存在的對外界環境條件應答反應的調控元件亦有所區別。所以分離相關基因啟動子、對啟動子中的順式元件進行功能分析是研究該基因表達調控及進一步有效利用的關鍵所在。

發明內容

本發明的目的在于提供了花生幾丁質酶基因的啟動子及其應用，本發明提供的全長序列啟動子及缺失部分序列的啟動子均屬于誘導型的啟動子，在水楊酸誘導下，其驅動的下游基因的表達量均有所提高。

為實現上述發明目的，本發明采用下述技術方案予以實現：

花生幾丁質酶基因啟動子Ah-Chi-P，其具有序列表SEQ?ID?No:1所示的堿基序列。

花生幾丁質酶基因啟動子Ah-Chi-P1，其具有序列表SEQ?ID?No:2所示的堿基序列。

花生幾丁質酶基因啟動子Ah-Chi-P2，其具有序列表SEQ?ID?No:3所示的堿基序列。

花生幾丁質酶基因啟動子Ah-Chi-P3，其具有序列表SEQ?ID?No:4所示的堿基序列。

花生幾丁質酶基因啟動子Ah-Chi-P4，其具有序列表SEQ?ID?No:5所示的堿基序列。

花生幾丁質酶基因啟動子Ah-Chi-P5，其具有序列表SEQ?ID?No:6所示的堿基序列。

上述六種所述啟動子是被水楊酸誘導的誘導型啟動子。

本發明還提供了含有所述的花生幾丁質酶基因啟動子的重組載體。

本發明還提供了所述的啟動子在驅動花生中幾丁質酶基因和洋蔥中GUS基因表達中的應用。

所述啟動子Ah-Chi-P驅動花生內源幾丁質酶基因的表達，在水楊酸誘導后72h表達量有所提高；所述啟動子Ah-Chi-P及相應缺失啟動子Ah-Chi-P1、P2、P3、P4、P5在水楊酸誘導后84h，GUS酶活性均得以提高。