[發明專利]基于噬菌體展示表位的甲型流感病毒抗原阻斷ELISA檢測方法

無效

• 申請號: 201410091600.3
• 申請日: 2014-03-13
• 公開（公告）號: CN103837683A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發明（設計）人: 張富強;張文東;范泉水;宋建領;趙煥云;張應國;胡挺松;邱薇;鄭穎
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍成都軍區疾病預防控制中心
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

1.一種基于噬菌體展示表位的甲型流感病毒抗原阻斷ELISA檢測方法，其特征在于，該基于噬菌體展示表位的甲型流感病毒抗原阻斷ELISA檢測方法包括：

首先將甲型流感病毒型或亞型特異性單克隆抗體包被于ELISA板上，形成固相抗體；加待檢樣品，樣品中的病毒抗原與包被抗體或單克隆抗體結合；加噬菌體展示的甲型流感病毒型或亞型特異性表或擬位，噬菌體表或擬位與未結合抗原的包被抗體或單克隆抗體結合；加酶標二抗或HRP標記的鼠抗M13單克隆抗體，酶標二抗與噬菌體表面蛋白結合；固相載體上的酶量就代表與包被抗體或單克隆抗體結合的噬菌體表或擬位的量；加底物顯色后根據顏色深度計算抑制率，進行病毒抗原定性檢測。

2.如權利要求1所述的基于噬菌體展示表位的甲型流感病毒抗原阻斷ELISA檢測方法，其特征在于，該基于噬菌體展示表位的甲型流感病毒抗原阻斷ELISA檢測方法包括以下步驟：

步驟一，包被抗體，分別采用3種甲型流感病毒型特異性單克隆抗體、3種H5亞型特異性單克隆抗體或1種H9亞型特異性單克隆抗體作為包被抗體；

步驟二，指示抗原----噬菌體表位，分別采用甲型流感病毒型或H5、H9亞型特異性單克隆抗體，篩選M13噬菌體展示的12肽隨機肽庫，獲得與單克隆抗體特異性結合的噬菌體展示的表位，且單克隆抗體與噬菌體展示的表位的結合能被病毒型或亞型特異性抗原阻斷，獲得的噬菌體展示的表位基序作為指示抗原；

步驟三，抗體包被，將甲型流感病毒型或H5、H9亞型特異性單克隆抗體用0.05mol／L碳酸鹽緩沖液稀釋到工作濃度，加至96孔ELISA板，每孔加50μL，振蕩混勻，4℃保濕過夜，用PBST洗板5次，鋁箔紙密封4℃保存，每孔加PBST-SM100μL，室溫振蕩30min封閉，，用PBST洗板5次；

步驟四，加樣，將待檢病毒樣品200μL，待檢病毒樣品包括細胞培養上清液、組織勻漿上清液、雞胚尿囊液等，每份樣品使用兩孔；強陽性對照兩孔，各孔加200μL；弱陽性對照兩孔，各孔加200μL；陰性對照兩孔，各加入200μL；室溫靜置30min，置37℃溫箱振蕩溫育反應30min；

步驟五，將攜帶甲型流感病毒型或H5、H9亞型特異性表（擬）位的噬菌體稀釋到工作濃度，每孔加50μL；置37℃溫箱振蕩溫育反應30min；用PBST洗板5次，甩干；將HRP標記的鼠抗M13單克隆抗體用PBST-SM稀釋到工作濃度，每孔加50μL；置37℃溫箱振蕩溫育反應30min；用PBST洗板5次，甩干；

步驟六，按以下比例配置底物工作液：9.7mL乙酸--檸檬酸緩沖液+50μL30％過氧化氫+300μL四甲基聯苯胺儲存液，每孔100μL加至ELISA板，室溫避光反應10min～20min，用2mol／L的硫酸每孔50μL，終止反應；

步驟七，在終止反應15min內，用酶標讀板儀讀取450nm波長的每孔吸光度值，計算抑制率。

3.如權利要求2所述的基于噬菌體展示表位的甲型流感病毒抗原阻斷ELISA檢測方法，其特征在于，在步驟七中，計算抑制率的公式為：

抑制率I（%）=（1–待檢樣品OD值/陰性樣品OD值）X100。

4.如權利要求2所述的基于噬菌體展示表位的甲型流感病毒抗原阻斷ELISA檢測方法，其特征在于，在步驟七中，判定的條件尾：陰性對照OD值應在0.8～1.4范圍內，強陽性對照抑制率應大于85％，弱陽性抑制率應在30％～40%之間，如果實際值與此值偏離較大，則不具備判定條件，需重復或重新滴定各組份工作濃度。

5.如權利要求2所述的基于噬菌體展示表位的甲型流感病毒抗原阻斷ELISA檢測方法，其特征在于，在步驟七中，判定的結果：樣品的抑制率大于40%判定為甲型流感病毒型或亞型特異性抗原陽性，小于30％判定為陰性；30％～40％之間應重復，若仍為此值可判定為弱陽性。

6.如權利要求2所述的基于噬菌體展示表位的甲型流感病毒抗原阻斷ELISA檢測方法，其特征在于，該基于噬菌體展示表位的甲型流感病毒抗原阻斷ELISA檢測方法適用于檢測和鑒定臨床組織浸出液或懸液、雞胚尿囊液、細胞培養上清液中的甲型流感病毒抗原或禽流感病毒H5、H9亞型抗原。