[發明專利]一種基于SSR與毛細管電泳技術鑒定甘蔗種質資源的方法

無效

• 申請號: 201410090829.5
• 申請日: 2014-03-13
• 公開（公告）號: CN104017859A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 梁俊;劉守廷;甘志勇;莫璋紅;宋雪萍;甘國勇
• 申請（專利權）人: 南寧泰格瑞農業科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N27/447
• 代理公司: 廣西南寧明智專利商標代理有限責任公司 45106
• 代理人: 黎明天

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種利用SSR和毛細管電泳技術鑒定甘蔗種質資源的高通量檢測方法。

背景技術

我國是世界上古老的甘蔗種植國家之一，歷代甘蔗栽培品種類型很多。近年來，中國又引進、選育了適應于各種生態類型蔗區推廣的甘蔗品種120多個。但當前甘蔗栽培品種遺傳基礎狹窄，品種的形態、農藝性狀等生物學特性差異不大，如何鑒定甘蔗栽培品種及其雜交后代已成為當今甘蔗科研工作的重難點之一。

在DNA分子技術方法廣泛應用之前，人們主要是借助形態和農藝性狀、細胞核型分析、同工酶標記、染色體分析技術等實驗方法，對甘蔗栽培品種進行鑒定，但這些方法受環境、有限的標記數量等因素制約，不能得到廣泛推廣。DNA分子標記技術是DNA水平上遺傳多樣性的直接反映，具有數量多、穩定好、無表型效應，不受環境影響等優點。

DNA指紋技術是指能夠反映生物個體或種群間基因組中DNA位點差異的一種分子生物學技術。目前DNA分子標記已廣泛應用于甘蔗栽培品種指紋圖譜構建、遺傳分析、基因定位和分子標記輔助選擇等方面。與其它分子標記相比，SSR分子標記技術具有多態性豐富、共顯性遺傳方式、分析方法簡單、重復性好等優點。目前，對SSR標記技術的PCR產物檢測方法主要有熒光標記引物測序法、同位素標記引物的聚丙烯酰胺電泳法,?以及銀染聚丙烯酰胺PAGE（polyacrylamide?gel?electrophoresis）方法。PAGE是目前最常用的檢測方法，但其因需要銀染，使得檢測過程變得復雜，且不能準確讀出片段大小，只能粗略的估計。

毛細管電泳（capillary?electrophoresis,?CE）也叫高效毛細管電泳（HPCE）。是20世紀80年代后期在全球范圍內迅速崛起的一種分離分析技術。毛細管凝膠電泳和普通電泳相比，具有高靈敏度、高分辨率、高速度、樣品少等優點；因此，CE被逐步應用于檢測分子標記技術的PCR擴增產物。

發明內容

本發明的目的是解決甘蔗種質資源鑒定難的問題，提供一種高通量、操作簡單、結果準確可靠的甘蔗種子資源的鑒定方法。而將毛細管電泳技術與SSR分子標記技術結合，能夠為甘蔗親屬關系的鑒定、品種鑒定、種子真實性鑒定以及種子純度鑒定提供有力的支持。

本發明提供的甘蔗種質資源鑒定方法，其步驟為：提取甘蔗新鮮嫩葉DNA，利用12對SSR熒光引物與毛細管電泳技術相結合構建52個在中國廣泛種植的甘蔗品種DNA指紋數據庫，將待測品種或品系DNA指紋數據與已構建的甘蔗DNA指紋數據庫中的數據進行對比分析，判斷待測品種或品系的種類名稱。

作為本發明的進一步限定，所述12對SSR熒光引物為篩選得到的核心引物，其引物信息如下表：

作為本發明的進一步限定，所述DNA提取包括一些步驟：將甘蔗嫩葉于液氮研磨成粉末狀，加入1.2?ml?65℃預熱的SDS提取液，搖勻，65℃水浴45?min；加入200?μl?KAc(5?mol/L，pH4.8)，混勻后，冰浴15?min；4℃，10000?rpm?離心15?min，取1?ml上清液，加入等體積氯仿混勻；4℃，12000?rpm?離心7?min，取上清液，加1/10體積的NaAc?(3?mol/L，pH5.2)?和2倍體積的預冷無水乙醇，冰浴20?min；4℃，10000?rpm?離心10?min，棄上清，用70%酒精洗滌2次，晾干沉淀；加入200?μl已滅菌的TE溶液（pH8.0），溶解沉淀，即得DNA?溶液，置于-20℃保存備用；

作為本發明的進一步限定，所述PCR擴增的擴增程序為：首先95℃預變性5?min；隨后的30個循環為：94℃變性30?sec，退火30?sec（不同引物的具體溫度表1），72℃延伸30?sec；最后72℃下延伸2?min。

作為本發明的進一步限定，所述毛細管電泳分析方法為將所得到的PCR產物稀釋100倍后，在?BECKMAN?COULTER?CEQ?8000遺傳分析系統儀上利用毛細管電泳法檢測，每個CE樣品中含有1?μl?PCR產物、0.2?μl?Genescan-400分子量標準品和20?μl?SLS溶液。在毛細管凝膠電泳過程中，PCR產物與Genescan-400分子量標準品的熒光信號均由基因分析儀自動保存。