[發明專利]豬NR1H4基因的分子克隆及應用

有效

• 申請號: 201410090508.5
• 申請日: 2014-03-12
• 公開（公告）號: CN103898120A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 馬海明;楊虎;蔣雋;何俊;賀長青
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 湖南兆弘專利事務所 43008
• 代理人: 江巨鰲

技術領域

本發明屬于家畜分子生物學技術領域，涉及一種包含如SEQ?ID?NO：1所示豬基因核苷酸的核酸分子。本發明還涉及如SEQ?ID?NO：1所示的NR1H4基因的分子克隆方法及多核苷酸序列中的單核苷酸多態性位點以及檢測所述單核苷酸多態性位點的方法。

背景技術

豬肉是動物性蛋白的主要來源，隨著人們對肉需要量的增加，對肉質的要求也相應提高。影響豬肉質的因素有遺傳和非遺傳的，豬肌內脂肪含量對肉質性狀有很大的影響，一般來說，肌內脂肪含量越高，豬肉質越嫩，從而肉質越好。肉質性狀大多屬于數量性狀，由微效多基因控制。許多肉質性狀只能在動物屠宰后才能測定，所以常規選育只能進行同胞或半同胞測定，這樣必加大選育成本，且遺傳進展緩慢。豬基因組草圖的構建，使得尋找影響肉質性狀的主基因或與其緊連鎖的分子標記成為可能，這些分子標記一經確認，就可進行標記輔助選擇育種。利用分子標記進行輔助選擇（MAS）進行肉質性狀改良是一種有效的途徑。

NR1H4（Nuclear?Receptor?subfamily1,group?H,member4，NR1H4）基因，也稱為法尼酯衍生物X受體（Farnesoid?X?receptor，FXR），是核受體的超家族成員之一，屬核激素受體超家族，高于生理濃度的法尼酯衍生物輕度激活該蛋白，故又稱為法尼酯衍生物X受體或“孤兒”核受體，人和小鼠NR1H4蛋白有αl、α2、βl和β2幾種亞型。該蛋白氨基端為配體非依賴的轉錄活化域、DNA結合域、鉸鏈區和配體結合域，羧基端為配體依賴的轉錄活化域，具有典型的核受體結構。配體與配體結合域的結合改變了核受體空間構象，與靶基因啟動子結合調節靶基因的轉錄。初級鵝脫氧膽酸是NR1H4天然配體，人工合成的NR1H4配體有6-乙基鵝脫氧膽酸衍生物，其結合力比天然配體強數倍。次級膽汁酸石膽酸和脫氧膽酸可激活NR1H4。NR1H4蛋白對甘油三酯的形成有重要調節作用，而甘油三酯是脂肪的重要組成成分，NR1H4上調脂蛋白脂肪酶活化輔助因子載脂蛋白C-Ⅱ，下調脂肪酸合成的主要轉錄因子甾醇反應元件結合蛋白-lc，使有調節脂質形成的乙酰輔酶A合成酶、脂肪酸合成酶等表達下降，從而減少脂肪酸，下調抑制因子脂蛋白C-Ⅲ，誘導極低密度脂蛋白受體表達，使富含甘油三酯的脂蛋白分解。NR1H4基因可誘導原代培養肝細胞過氧化物酶體增殖物激活受體α和其靶基因丙酮酸脫氫酶激酶4，促進脂肪酸氧化。

NR1H4基因位于人染色體12q23.1，小鼠10號染色體C2|10，遺傳位置為44.98cM，大鼠（Rattus?norvegicus）染色體7q13，斑馬魚（Danio?rerio）18號染色體CH211-264E16.3，恒河獼猴（Macaca?mulatta）11號染色體，牛（Bos?taurus）5號染色體，家雞（Gallus?gallus）1號染色體，家豬（Sus?Scrofa）5號染色體上。

NR1H4基因在脂肪形成中發揮重要作用，是膽汁鹽受體，通過調控靶基因調節脂類形成，從而影響豬肌內脂肪的沉積，進而影響豬肉質性狀。但是，目前國內外關于豬NR1H4基因的研究很少。

發明內容

本發明的目的在于克隆豬NR1H4基因cDNA分子，尋找NR1H4基因的突變位點以及基因多態性的檢測方法，為豬肉質標記輔助育種提供一種有用的分子標記。

本發明所要解決的技術問題是：針對上述現有技術的不足，提供一種克隆和檢測豬NR1H4基因的分子標記及其應用，為豬肉質性狀標記輔助選擇提供有用的分子標記。

為了解決上述問題，本發明所采用的技術方案是：以人的NR1H4基因序列（GenBank收錄號為NM_001206993）為種子序列，在GenBank中利用BLASTN（Basic?Local?Alignment?Search?Tool?Nucleotide），參照其同源性在80%以上的豬EST（Expression?Sequence?Tags）設計特異引物，利用RACE（Rapid?Amplification?of?cDNA?End），克隆出豬NR1H4基因cDNA全長，該豬NR1H4基因的DNA序列如SEQ?ID?NO：1所示。NR1H4基因的多態性是利用比較基因組學方法根據人的NR1H4基因序列設計引物，以豬的基因組DNA為模板擴增，擴增片段利用測序篩選SNP，并利用PCR－RFLP進行基因分型技術，發現第709bp處有一個A/G的堿基突變，導致PCR-RFLP-Mwo?I多態性，并利用該標記檢測了中外豬種的情況。