[發明專利]用于早期糖尿病診斷的多肽標志物

無效

• 申請號: 201410090215.7
• 申請日: 2014-03-12
• 公開（公告）號: CN103897035A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 鄧玉林;張玫
• 申請（專利權）人: 北京理工大學
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C07K7/06;G01N30/02;G01N33/68
• 代理公司: 北京欣永瑞知識產權代理事務所(普通合伙) 11450
• 代理人: 張慶敏

1.一種用于早期糖尿病診斷的內標多肽，其特征在于，其來源于人血清白蛋白，具有SEQ?ID?NO.1所述的氨基酸序列。

2.權利要求1所述的內標多肽在制備早期糖尿病診斷試劑盒中的應用。

3.一種篩選權利要求1所述內標多肽的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）體外糖基化樣品的制備，將無菌HSA于50mM?pH7.4的PBS緩沖液中配成生理濃度的溶液，分別與4種不同濃度的D-葡萄糖在37℃水浴共同孵育10、20和30天，使得HSA與D-葡萄糖的摩爾比分別為1:10、1:41.5、1:83和1:415；以同樣條件下不添加D-葡萄糖溶液的反應體系作為空白對照；

（2）胰酶消化，蛋白樣品溶于50mM?pH8.3的NH₄HCO₃緩沖液中，向每200μg經糖基化的HSA與空白對照HSA樣品中加入20μL含8M尿素的10mM?DTT溶液進行變性，于37℃水浴孵育4h，再加入50mM?IAA溶液甲基化封閉氨基酸側鏈的活潑基團，于黑暗處反應1h，再加入溶于pH8.3的NH₄HCO₃緩沖液中的胰蛋白酶，使HSA:胰蛋白酶的質量比=10～125:1，于37℃水浴孵育8～20h；

（3）¹⁸O標記，將凍干后的肽段樣品溶于50～150mM?pH4.0～7.0的KH₂PO₄溶液中后凍干備用；向未經修飾的HSA-肽段和糖基化HSA-肽段加入分別用H₂¹⁸O和H₂¹⁶O溶解的胰蛋白酶，HSA:胰蛋白酶質量比=1～125:1，在37℃水浴中標記8～24小時；

（4）HPLC/ESI-TOF?MS方法對樣品進行定量分析和用HPLC/ESI-Ion?Trap?MS方法對樣品進行定性分析；

（5）數據分析與內標肽段的選擇，Agilent公司Mass?Hunter軟件的MFE算法用于提取HPLC/ESI-TOF?MS的數據特征，提取參數：保留時間8.00-45.00min；質荷比m/z300-1800；信噪比閾值S/N5；譜峰數目1000×1000；選中肽同位素分布；PeakPair軟件被用于挑選相應肽段的¹⁶O/¹⁸O峰對，并計算出¹⁶O/¹⁸O峰面積的比值用于肽段的定量分析，若¹⁶O/¹⁸O峰面積的比值小于1，則說明未經修飾的HSA來源的肽段被消耗，該肽段擁有易被修飾的糖基化位點，經過糖基化過程，生成了帶有糖鏈修飾的新肽段；若¹⁶O/¹⁸O峰面積的比值等于1，則說明該肽段經過與葡萄糖共育并未被消耗，不存在對葡萄糖敏感的糖基化位點；在TOF?MS數據中，發現1個葡萄糖不敏感肽段AAFTECCQAADKAACLLPK，m/z=977.4,Rt=28.7min均可在每一次質譜檢測中穩定地被檢測到，質譜信號達到10⁵，肽段的¹⁶O/¹⁸O峰面積比例最接近1，且SD值最小0.961±0.077，選擇該肽段為內標肽段。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟（3）還包括在標記完成后，殘余的胰蛋白酶需經滅活處理，將樣品在沸水中煮10分鐘，再按照體積比加入5%的甲酸。

5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟（3）中標記體系尿素濃度控制在2M以下。

6.如權利要求3所述的方法，其特征在于，在HPLC/ESI-TOF?MS分析之前，樣品需經過離心處理，離心條件為17,000×g,15min。

7.一種與權利要求1所述內標多肽聯合使用用于檢測早期糖尿病的多肽標志物，其特征在于，其來源于人血清白蛋白，具有SEQ?ID?NO.2所述的氨基酸序列。

8.一種與權利要求1所述內標多肽聯合使用用于檢測早期糖尿病的多肽標志物，其特征在于，其來源于人血清白蛋白，具有SEQ?ID?NO.5所述的氨基酸序列。