[發明專利]一種寡核苷酸和可消除質粒共轉化用于大腸桿菌必需基因點突變的方法

有效

• 申請號: 201410089063.9
• 申請日: 2014-03-12
• 公開（公告）號: CN103849640A
• 公開（公告）日: 2014-06-11
• 發明（設計）人: 尚廣東;駱希;張青;楊晨;花月
• 申請（專利權）人: 南京師范大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體是涉及一種利用寡核苷酸和可消除的質粒共轉化來實現大腸桿菌必需基因點突變的方法。

背景技術

大腸桿菌是研究的最為透徹，也是具有重要生物學用途和工業實踐用途的微生物菌株。必需基因指對生物體生存所必需的一類基因。大腸桿菌基因組上的必需基因的點突變是研究基因功能、改變基因所表達的酶的催化特征以及構建新的基因工程菌株的重要手段。

經典的必需基因點突變的方法是首先在構建一個含點突變片段的重組克隆，突變位點兩側含有用于同源重組的同源片段。所采用的載體常常為需要Pir蛋白進行復制的R6K復制子或者溫度敏感型復制子，利用前者不能再大腸桿菌中復制以及后者在高溫下不能復制的特點，通過突變位點一側的同源片段整合至大腸桿菌染色體中。載體仍需含有負篩選標記，如編碼蔗糖6-果糖轉移酶的sacB基因。利用在培養基中添加10%蔗糖的方法，SacB將蔗糖轉化為有毒性的聚蔗糖，這樣促使菌體通過突變位點另外一側的同源片段進行第二次的同源重組而去除質粒骨架。此后，PCR擴增目的區域，通過序列測定來確認獲得點突變的菌株。此方法步驟繁瑣耗時，涉及多個基因克隆的步驟，且最后一步篩選時，可能恢復至原株的基因型，獲得突變菌株的幾率相差較大。而在必需基因突變時，獲得原株的幾率遠遠大于突變菌株的幾率，可能需要篩選大量的克隆才能獲得目的的突變菌株。

上世紀末發展并逐漸得到廣泛應用的重組工程為大腸桿菌必需基因的點突變提供了新穎的思路。重組工程利用重組酶催化的DNA片段之間的同源重組而進行DNA的修飾和克隆。目前使用廣泛的重組酶來自于lambda噬菌體，分別為編碼DNA5'→3外切酶的redα基因，Redα作用于雙鏈DNA得到3'端突出的DNA分子；編碼DNA單鏈結合蛋白的redβ基因，Redβ其結合在3'端突出的DNA分子上，Redβ也是關鍵的重組酶，即催化同源片段之間同源重組；redγ基因編碼抑制內源性核酸酶的Gam蛋白，Gam保護外源的DNA片段免受內源性DNA酶的降解。與較傳統的DNA克隆和修飾相比，重組工程最為顯著的優點表現在：可催化短至36個堿基的同源片段之間的同源重組，而短的堿基可通過化學合成的PCR引物來獲得，無需多個基因克隆的步驟，這就大大簡化了操作流程；可同時針對多個基因、多個位點修飾進行操作。

對單鏈寡核苷酸而言，單獨的redβ基因即可行使重組功能。利用寡核苷酸對大腸桿菌基因組進行修飾而實現必需基因的點突變是近年來發展的手段。但由于沒有篩選標記，突變效率一般極低（常在0.1%以下），難以通過常規的方法篩選得到，需要昂貴的高通量儀器和大量篩選才能運用此手段。有研究人員利用兩個寡核苷酸共轉化的方法來實現突變，一個為突變寡核苷酸，另外一個為與基因組上位點重組后可行使正篩選（如抗生素抗性）的寡核苷酸。但這個突變位點需預先引入，且不能重復使用，這就制約了多重突變。

本專利申請的研究人員曾提出利用重組工程手段，首先通過PCR引入抗性基因盒，再通過巨型核酸酶I-SceI介導的雙鏈斷裂修復的方法實現基因組的點突變（專利公開號：CN102703424A）。雖然有著較高的突變效率，但此方法對必需基因的修飾則方法難以實行，因為引入抗性基因將破壞必需基因的開放閱讀框而使基因失活，菌株不能生存。

發明內容

針對上述問題，本發明提供了一種通過寡核苷酸和可消除的質粒共轉化對大腸桿菌必需基因點突變的方法。

具體的實驗原理如下。將前面四個堿基以硫磷酰基連接的、長度為91個堿基、中間為突變位點的寡核苷酸和可消除的質粒pLS1755共轉化至表達重組酶的大腸桿菌。磷硫酰鍵連接的核苷酸可避免菌體內部核酸酶的降解。pLS1755含50bp與lacZ基因的同源序列、氨芐青霉素抗性基因，誘導表達的I-SceI基因以及兩個I-SceI酶切位點，復制子為R6K。寡核苷酸和共轉化至表達重組酶的大腸桿菌時，由于pLS1755不能自主復制，在氨芐青霉素篩選之下，重組酶催化的pLS1755所含的50bp和基因組上同源片段發生同源重組，得到pLS1755整合型菌株。寡核苷酸也同時為重組酶的底物，因此在氨芐青霉素抗性、pLS1755整合的菌株中，含有一定比例的突變菌株。如此可篩選得到由寡核苷酸突變而引起的必需基因點突變的菌株。