[發明專利]禾谷縊管蚜EF1-α內參基因部分序列、克隆方法及其應用

有效

• 申請號: 201410088772.5
• 申請日: 2014-03-11
• 公開（公告）號: CN103805610A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 王錫鋒;武科科;劉艷
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 北京兆君聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 11333
• 代理人: 胡敬紅

1.禾谷縊管蚜EF1-α基因片段，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。

2.一種禾谷縊管蚜EF1-α基因的部分序列的克隆方法，提取禾谷縊管蚜基因組總RNA，采用引物EF1-αR進行RT-PCR擴增，以產物第一鏈cDNA作為模板、以引物對EF1-αF/EF1-αR進行PCR擴增，得到陽性克隆，最后經測序驗證。其中引物序列為：

EF1-αF：5′-ATTGATATTGCTTTATGGAAATTCG-3′；

EF1-αR：5′-ACCAGGGTGGTTCAATACAATAAC-3′。

3.根據權利要求2所述的克隆方法，所述PCR擴增的反應條件如下：94℃3min,[94℃30s、56℃45s，72℃1min]30個循環，72℃延長10min，4℃保存。

4.一種qPCR擴增EF1-α基因部分序列的方法，抽提禾谷縊管蚜基因組總RNA，以試劑盒自帶混合引物為引物進行RT反應，然后以產物第一鏈cDNA作為模板進行定量PCR擴增，熒光染料為SYBR?Green?I，其中定量PCR擴增中的禾谷縊管蚜的定量引物，其序列為：

QEF1-αF：5′-TAGACGCTATCCTACCCCCCA-3′；

QEF1-αR：5′-GTGAAATCAGCAGCACCCTTG-3′。

5.根據權利要求4所述的方法，所述定量PCR擴增采用兩步法，即在95℃預變性15min之后，先運行40個循環的95℃10sec，59.2℃32sec，72℃32sec，再運行溶解曲線階段的95℃15sec，60℃1min，95℃30sec，60℃15sec。

6.權利要求1所述的禾谷縊管蚜EF1-α基因片段作為內參基因應用于禾谷縊管蚜功能基因或介體內黃矮病毒基因表達定量PCR檢測的應用。