[發(fā)明專利]一種堿性脂肪酶突變體

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410088757.0
• 申請(qǐng)日: 2014-03-11
• 公開（公告）號(hào): CN103865896A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王華明;徐娟;吳秀秀;黃亦鈞
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海康地恩生物科技有限公司;青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/20
• 分類號(hào): C12N9/20;C12N15/55;C12N15/80;C12N1/15;C11D3/386;C12R1/685
• 代理公司: 青島海昊知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于功能基因改造與篩選技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種堿性脂肪酶體突變體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

脂肪酶(E.C.3.1.1.3)又名甘油酯水解酶、三酰基甘油酰基水解酶，是一類可以水解甘油三酯產(chǎn)生不同鏈長游離脂肪酸和甘油的水解酶。它是生物體內(nèi)一類重要的代謝酶，從催化特性看，它具有高度的化學(xué)選擇性和立體異構(gòu)性，且反應(yīng)不需輔酶，反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少。脂肪酶的一個(gè)顯著特征是它不同于多數(shù)水解酶的催化特性，它是一類非水相酶，其催化反應(yīng)是在油水界面上進(jìn)行，對(duì)于水溶性底物不起催化作用。不同來源的脂肪酶作用于底物甘油三酯的酯鍵位置不同。

脂肪酶作為一種重要的工業(yè)用酶，可以催化水解、酯合成、酯交換、轉(zhuǎn)酯化等一系列反應(yīng)，因此在食品、皮革、飼料、洗滌、醫(yī)藥、油脂、化工等傳統(tǒng)工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

從二十世紀(jì)開始，美國等國家就開展了對(duì)堿性脂肪酶的研究，并不斷推出市場化產(chǎn)品，然而，國內(nèi)對(duì)堿性脂肪酶的研究起步較晚，在堿性脂肪酶發(fā)酵菌種、酶學(xué)性質(zhì)、酶活性以及應(yīng)用效果等方面與國外的先進(jìn)技術(shù)有很大的差距，這樣不利于產(chǎn)品的后處理及長期穩(wěn)定存放，更影響了其產(chǎn)業(yè)化、市場化發(fā)展。因此，急需開發(fā)新的酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)良、產(chǎn)量高的堿性脂肪酶，提高洗滌效果，并降低生產(chǎn)成本，從而促進(jìn)堿性脂肪酶的廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，提供了一種新型堿性脂肪酶突變體及其在洗滌劑中的應(yīng)用。本發(fā)明通過大量隨機(jī)突變的篩選，得到一種耐熱性、熱穩(wěn)定性均顯著提高的脂肪酶突變體，并構(gòu)建得到高效表達(dá)該突變體的黑曲霉工程菌，從而為該突變體的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

本發(fā)明一個(gè)方面涉及一種堿性脂肪酶突變體，是氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1的脂肪酶的第78位氨基酸由Glu變?yōu)锳rg，第187位氨基酸由Asp變?yōu)锳rg。

上述堿性脂肪酶突變體的氨基酸序列為SEQ?ID?NO：3，其編碼基因的核酸序列為SEQ?ID?NO：4。

本發(fā)明另一方面涉及攜帶有編碼序列為SEQ?ID?NO：4的堿性脂肪酶突變體基因的重組質(zhì)粒。

本發(fā)明還涉及一種工程菌株，其攜帶有上述重組質(zhì)粒。

所述工程菌株為黑曲霉（Aspergillus?niger）。

本發(fā)明的堿性脂肪酶突變體用于制備洗滌劑。

本發(fā)明提供了一種新型的堿性脂肪酶突變體，并通過構(gòu)建黑曲霉工程菌高效體外表達(dá)該脂肪酶突變體，發(fā)酵酶活高達(dá)4429U/mL。該脂肪酶突變體的最適作用pH為9.5，在pH7.0、9.0、11.0條件下的相對(duì)酶活顯著高于野生型，作用pH更為寬泛；最適作用溫度為35℃，在25-35℃、50-60℃范圍內(nèi)，脂肪酶突變體的相對(duì)酶活顯著高于野生型，尤其在55℃條件下突變體的相對(duì)酶活比野生型提高了約20%，耐熱性更強(qiáng)；此外，脂肪酶突變體的熱穩(wěn)定性顯著高于野生型，更有利于該酶及含酶產(chǎn)品的后處理及貯存。所述脂肪酶突變體可廣泛應(yīng)用于洗滌劑中，在相同添加量的情況下，含脂肪酶突變體的洗滌劑對(duì)皮脂污布的洗滌效果要顯著高于含野生型脂肪酶的洗滌劑，前景廣闊。

附圖說明

圖1：黑曲霉lipN和黑曲霉lipN-m1菌株發(fā)酵液SDS-PAGE電泳圖；其中，箭頭所指32kD處，即為重組表達(dá)的堿性脂肪酶。

圖2：脂肪酶突變體lipN與野生型lipN-m1相對(duì)酶活-pH變化曲線。

圖3：脂肪酶突變體lipN與野生型lipN-m1相對(duì)酶活-溫度變化曲線。

圖4：脂肪酶突變體lipN與野生型lipN-m1自身熱穩(wěn)定性變化曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的方法做進(jìn)一步說明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常可按常規(guī)條件，如J.薩姆布魯克（Sambrook）等編寫的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運(yùn)行。本領(lǐng)域相關(guān)的技術(shù)人員可以借助實(shí)施例更好地理解和掌握本發(fā)明。但是，本發(fā)明的保護(hù)和權(quán)利要求范圍不僅限于所提供的具體案例，而應(yīng)包括本領(lǐng)域技術(shù)人員在本說明書基礎(chǔ)上，不需經(jīng)過創(chuàng)造性勞動(dòng)就能擴(kuò)展的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1：堿性脂肪酶基因的隨機(jī)突變篩選