[發明專利]一種利用蛋白支架提高釀酒酵母中鯊烯的合成方法

無效

• 申請號: 201410088307.1
• 申請日: 2014-03-11
• 公開（公告）號: CN103849643A
• 公開（公告）日: 2014-06-11
• 發明（設計）人: 李春;曹欠;張根林
• 申請（專利權）人: 北京理工大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C12N15/62;C12N15/10;C12P5/02;C12R1/865
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技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，涉及一種利用蛋白支架提高釀酒酵母中鯊烯的合成方法。

背景技術

鯊烯(squalene)又名角鯊烯、三十碳六烯、魚肝油萜，化學名為2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯，是一種高度不飽和烴類化合物，是萜類及固醇類化合物合成的重要前體物質。最初由日本化學家Tsujimoto于1906年在黑鯊魚肝油中發現。鯊烯具有極強的供氧能力，在抑制癌細胞生成、擴散和緩解因化療而導致的白細胞數量減少等方面具有顯著的療效，對胃癌、食道癌、肺癌，卵巢癌，具有顯著的治療作用。鯊烯還具有良好的抗感染，抗疲勞功效，主要應用于保健品和醫療衛生保健行業。

目前工業提取角鯊烯的方法是從鯊魚肝油中提取。由于近年來人類對海洋生態的影響，海洋生態形勢日趨嚴峻，海洋漁業資源瀕臨枯竭，因而使用動物油脂尤其是鯊魚肝油中提取角鯊烯的傳統工藝必定會逐漸淘汰。并且從海洋動物油脂中提取的角鯊烯帶有難以去除的異味，致使其不利于作為添加劑加入到化妝品和保健食品中。因此傳統的提取生產工藝必定會被其他生產方式所替代。長期以來，人們發現鯊烯在橄欖油、大豆油、米糠油中均有少量的分布，從植物中提取鯊烯生產成本過高，難以通過實現大規模的工業化生產以滿足日益增長的市場需求。用化學合成的方法來合成鯊烯不僅步驟繁瑣，而且得到的產物難以分離純化，不能用于純度要求極高的醫藥和保健品行業。因此，尋求一種生產成本低，分離提取簡單高效的鯊烯大規模生產方法是十分必要的。

用微生物細胞生產鯊烯引起了科學家的關注。釀酒酵母作為一種模式微生物，不僅生長繁殖快，遺傳背景清楚，而且食品安全。釀酒酵母本身也是可以合成鯊烯的，但是鯊烯合成途徑存在限速步驟，代謝分流，中間產物對細胞的毒害作用以及多酶催化傳質阻力等問題，導致鯊烯的合成能力低，無法實現用微生物大量生產鯊烯。

發明內容

本發明的目的是為解決釀酒酵母生產鯊烯能力低的局限，提供一種利用通過蛋白支架共區域化鯊烯合成途徑關鍵酶，從而提高釀酒酵母生產鯊烯能力的方法。

為達到上述目的，本發明人工化學合成經過密碼子優化的GBD，WH1，PDZ三個蛋白結構域，通過兩段多肽連接器將三個結構域按順序做成一個融合蛋白。用來源于釀酒酵母的啟動子FBA1和對應的終止子FBA1啟動和終止該融合蛋白的轉錄。

克隆來自E.coli?BL21(DE3)的異戊烯基焦磷酸異構酶（IDI），來自Saccharomyces?cerevisiae?INVSC1的法尼基焦磷酸合酶（FPPS）和鯊烯合酶（SQS），將GBD，WH1和PDZ的配基分別通過多肽連接器與IDI，FPPS和SQS的N端或C端融合，做成三個融合蛋白。用三個來源于釀酒酵母的啟動子Nam2，Ala1，Gpm1和對應的終止子Nam2，Ala1，Gpm1分別啟動和終止三個融合蛋白的轉錄。

將以上構建的四個融合蛋白與經Sal?I和BamH?I雙酶切后的單拷貝質粒pRS41H共同轉入釀酒酵母INVSc1中，通過釀酒酵母自身的同源重組實現四個融合蛋白和質粒的連接，以質粒形式表達酶和蛋白支架共同組成的多酶復合體，構建的工程菌株為pRS41H-scaf。

本發明的釀酒酵母工程pRS41H-scaf，為在其中將強化表達的IDI，FPPS，SQS通過蛋白支架共區域化構建人工多酶復合體，來提高釀酒酵母鯊烯的生產能力。

本發明方法具有以下優點：

1、本發明通過蛋白支架的形式將鯊烯合成途徑的關鍵酶共區域化，模擬天然的底物隧道效應，有效的減少傳質阻力。

2、本發明通過將FPP與SQS共區域化一方面可以減少有毒中間代謝物FPP向周圍的擴散，另一方面，也可以加速FPP向鯊烯的快速轉化，減少FPP其對細胞的毒害作用。

具體實施方式

下面結合實施例，對本發明的具體實施方式進一步詳細描述。

實施例1：用連接器組合1構建融合蛋白工程菌

1、克隆經密碼子優化的GBD，WH1，PDZ三個基因，通過OE-PCR用兩段9個甘氨酸和絲氨酸交替排列組成的連接器將GBD，WH1，PDZ組成一個融合基因，然后與啟動子FBA1和終止子FBA1同樣通過OE-PCR連接成一個大的融合基因。