[發明專利]永生化人軟骨終板干細胞系的制備方法及其用途

有效

• 申請號: 201410088040.6
• 申請日: 2014-03-11
• 公開（公告）號: CN103865877A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 黃博;劉銘漢;王海;劉蘭濤;周躍
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第二附屬醫院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;A61L27/38;C12R1/91
• 代理公司: 重慶華科專利事務所 50123
• 代理人: 康海燕

1.永生化人退變軟骨終板干細胞系的制備方法，其特征在于：將外源性猴腎病毒SV40T抗原基因轉染人終板軟骨干細胞而誘導獲得永生化人終板軟骨干細胞系；其中，外源性SV40T抗原基因通過構建成慢病毒顆粒轉染人終板軟骨干細胞；所述外源性SV40T抗原的核苷酸序列如序列21所示；包括如下步驟：

a、構建SV40T抗原病毒載體：將表達SV40T抗原基因的逆轉錄病毒載體和包裝載體共轉染人胚腎293細胞系HEK293，包裝出表達SV40T抗原的逆轉錄病毒；

b、慢病毒轉染：將人退變軟骨終板原代干細胞傳至第3代，使細胞密度為3×10³/ml，按0.5ml/cm²培養面積添加含4μg/ml聚凝胺的逆轉錄病毒，病毒滴度為1×10⁸TU/ml，感染2天后，換液并添加2ml的0.4mg/ml的潮霉素B篩選14天，形成篩選后的干細胞集落；

c、傳代：將篩選后的干細胞集落擴增并進行連續傳至30代以上，即得到永生化的人退變軟骨終板干細胞系，凍存備用。

2.如權利要求1所述的永生化人退變軟骨終板干細胞系的制備方法，其特征在于：步驟b中的人退變軟骨終板原代干細胞采用如下方法制備：將手術中遺棄的軟骨終板標本，在無菌條件下去除棉絮狀的髓核組織和白色的纖維狀纖維環組織，得到透明狀的軟骨終板；機械-膠原酶法獲取軟骨終板原代細胞。

3.如權利要求1或2所述的永生化人退變軟骨終板干細胞系的制備方法，其特征在于：步驟b中人退變軟骨終板原代干細胞傳至第3代的培養條件如下：培養基為90%DMEM/F12，含10%的胎牛血清，細胞長滿接近培養皿80%后傳代。

4.由權利要求1～3任一項所述的方法得到的永生化的人退變軟骨終板干細胞系。

5.由權利要求1～3任一項所述的方法得到的永生化的人退變軟骨終板干細胞系在制備骨組織工程材料中的用途。