[發明專利]一種聯產香葉醇和橙花醇的基因工程菌及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201410086945.X
• 申請日: 2014-03-11
• 公開（公告）號: CN103898037B
• 公開（公告）日: 2017-11-17
• 發明（設計）人: 咸漠;劉煒;田寧;蔣昱東
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/74;C12P7/04;C12R1/125;C12R1/19;C12R1/22
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙)11419
• 代理人: 何自剛,王玉松

技術領域

本發明涉及一種聯產香葉醇和橙花醇的基因工程菌及其構建方法和應用，屬于基因工程技術領域。

背景技術

香葉醇（反-3，7-甲基-2，6-辛二烯-1-醇，Geraniol，又稱牻牛兒醇）及其同分異構體橙花醇（順-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醇，nerol）是一種非環單萜醇類化合物，是玫瑰油、馬丁香油和香茅油等香精油的主要成分之一。香葉醇和橙花醇及其酯可用于香精和食用香精，是玫瑰系香精的主劑，還可廣泛應用于藥物、煙草、食品配料。此外，還可用作天然低毒防蟲劑，一類新型的化學防癌制劑。目前橙花醇的全球年需求量在5000噸左右，其中我國的需求量也不低于500噸，而全世界的生產能力只有3000噸左右。

香葉醇和橙花醇天然存在于天竺葵、蕓香草、香茅、玫瑰花等50多種植物中。從天然植物中提取出揮發油，仍是市場上的主要來源。但是，由于人工培植受氣候影響較大，且隨著人力成本的上升，天然香葉醇的數量和成本難以穩定，供應不能得到保證。

工業上生產香葉醇和橙花醇是以月桂烯為原料，月桂烯的一級氯化物與乙酸鈉共熱，得香葉醇和橙花醇的乙酸酯混合物。然后將此粗酯皂化，再蒸餾得約含60%牻牛兒醇和40%橙花醇的混合物，仔細分餾可得高品級的香葉醇。黃宇平等以芳樟醇為原料，合成出香葉醇和橙花醇。以檸檬醛為原料制備橙花醇香葉醇的合成方法已有許多報道，例如催化氫化法，醇鋁法，硼氫化鈉法。尹顯洪對硼氫化鈉法進行改進研究，以水和苯作混合溶劑，替代純有機溶劑。采用相轉移催化方法，提高反應速率。但是，化學法存在環境污染、條件苛刻等問題，且合成的產品雜質多，影響了香葉醇的品質及下游應用。

發明內容

本發明要解決的問題是提供一種以葡萄糖為底物合成香葉醇和橙花醇的基因工程菌。

所述基因工程菌是在能夠表達香葉基焦磷酸的微生物中導入了香葉醇合成酶基因或磷酸酶基因得到的基因工程菌。

所述微生物為常用于分子生物學改造的微生物，優選大腸桿菌。

所述基因工程菌共表達了乙酰輔酶A酰基轉移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構酶、香葉酯二磷酸合成酶，以及香葉醇合成酶或磷酸酶。

所述乙酰輔酶A酰基轉移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶來源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或細菌，或其它生物體，優選糞腸球菌（Enterococcusfaecalis）。

所述3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶來源于：釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或細菌，或其它生物體，優選糞腸球菌（Enterococcusfaecalis）。

所述甲羥戊酸激酶來源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或細菌，或其它生物體，優選釀酒酵母。

所述甲羥戊酸-5-磷酸激酶來源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或細菌，或其它生物體，優選釀酒酵母。

所述甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶來源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或細菌，或其它生物體，優選釀酒酵母。

所述異戊烯焦磷酸異構酶來源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或細菌，或其它生物體，優選釀酒酵母。

所述香葉酯二磷酸合成酶來源于大腸桿菌(Escherichia coli)，或北美冷杉(Abiesgrandis)其它生物體，優選北美冷杉。

所述香葉醇合成酶來源于甜羅勒(Sweet Basil)，或細毛樟(Cinnamomum tenuipilum)，或其它生物體。優選來源于甜羅勒的香葉醇合成酶，其核苷酸序列如GenBank:AY362553.1所示。