[發(fā)明專利]一種制備抗Lp（a）多克隆抗血清的引物、質(zhì)粒及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410085897.2
• 申請(qǐng)日: 2014-03-10
• 公開（公告）號(hào): CN104059908A
• 公開（公告）日: 2014-09-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝桂華;柴寶玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳市寶凱侖科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12N15/63;C07K16/18;C07K16/06
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44281
• 代理人: 彭家恩;郭燕

技術(shù)領(lǐng)域

本申請(qǐng)涉及抗血清制備領(lǐng)域，特別是涉及一種用于制備抗Lp（a）多克隆抗血清的引物、質(zhì)粒，以及該引物和質(zhì)粒的應(yīng)用。

背景技術(shù)

血漿脂蛋白按密度分為四大類：乳糜微粒(縮寫，CM)、極低密度脂蛋白(縮寫，VLDL)、低密度脂蛋白(縮寫，LDL)和高密度脂蛋白(縮寫，HDL)。同時(shí)，在血漿中還存在一類特殊的脂蛋白：脂蛋白(a)（縮寫，Lp(a)），它是一個(gè)獨(dú)立的脂蛋白系統(tǒng)。Lp(a)的脂質(zhì)成分與LDL相似，主要由膽固醇脂和甘油三酯組成，表面被覆一層磷脂和游離膽固醇，甘油三酯的組份大于LDL，Lp(a)與LDL均是膽固醇轉(zhuǎn)移蛋白的底物。Lp(a)含有兩類載脂蛋白：ApoB100和Apo(a)，前者與LDL的ApoB100相同，ApoB100上有LDL受體結(jié)合位點(diǎn)；后者是Lp(a)的獨(dú)特載脂蛋白，ApoB100和Apo(a)通過1至2個(gè)二硫鍵共價(jià)相連。

從Apo(a)的N-末端到C-末端，所有的Kringle域通過兩兩之間的大約30個(gè)氨基酸的中間序列依次相連。除最靠近C端的Kringle域與纖溶酶原中的Kringle5同源外，其余Kringle域均與纖溶酶原中的Kringle4同源，并依次被命名為KringleⅣ1～10型；需要說明的是，人類Apo(a)與人纖維蛋白溶酶原(英文名，Plasminogen.縮寫，PLG)在DNA和蛋白質(zhì)水平均存在80%的同源性，從而具有共同的抗原決定簇，呈免疫交叉反應(yīng)。在所有這10型的KringleⅣ中，不同個(gè)體的KringleⅣ2型的串聯(lián)重復(fù)數(shù)一般在3～43之間變化，因此Apo(a)的分子量也就在250～838kD的范圍中變化，其體積與分子量在相同的個(gè)體內(nèi)或不同的個(gè)體間都具有較大的差異，因其這種特性，決定了Lp(a)在不同的個(gè)體間具有較大的差異。KringleⅣ9型中有7個(gè)半胱氨酸，其中未參與分子內(nèi)二硫鍵的第4057位半胱氨酸(縮寫，Cys4057)與載脂蛋白B-100中的第4326位半胱氨酸(縮寫，Cys4326)形成分子間二硫鍵，進(jìn)而組成完整的Lp(a)。

Lp(a)是動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，是冠心病(CHD)、心肌梗塞(MI)、腦卒中、動(dòng)脈重新狹窄的危險(xiǎn)因子。另外，Lp(a)水平可作為慢性腎功能衰竭合并心腦血管病及血栓形成的預(yù)示指標(biāo)。Lp(a)的血清水平受遺傳因素的高度影響，個(gè)體差異很大，主要由Apo(a)基因決定，因種族而異，與性別、年齡無關(guān)，不易受環(huán)境，生活方式和一般降脂藥物的干擾，僅能夠被腎衰、急性免疫反應(yīng)輕微影響。一般把人血清Lp(a)正常值定為<300mg/L。因此，Lp(a)的檢測對(duì)臨床分析和病理分析具有重要的參考價(jià)值。

目前，已知的檢測Lp(a)濃度的方法有酶聯(lián)免疫法、放射免疫法、熒光免疫測定法和免疫比濁法，以上免疫檢測方法均需要特異性強(qiáng)的Lp(a)抗血清/抗體作為核心原料。目前基本上都是采用提純?nèi)搜宓姆椒ㄖ苽涿庖咴璍p(a)或Apo(a)，即利用超高速離心機(jī)通過密度梯度離心制取Lp(a)，或者利用SDS-PAGE電泳分離獲得Apo(a)抗原；再利用抗原免疫動(dòng)物獲得抗血清。如前面分析，因?yàn)長p(a)含有兩類載脂蛋白：ApoB100和Apo(a)，其中ApoB100與LDL的ApoB100相同，所以利用Lp(a)作為免疫原制備的抗血清會(huì)與LDL存在免疫交叉反應(yīng)。而利用Apo(a)作為免疫原，因Apo(a)的氨基酸結(jié)構(gòu)與PLG很相似，而PLG是一種以較高濃度存在于人血液中的蛋白質(zhì)，因此，利用Apo(a)作為免疫原制得的抗血清會(huì)因與PLG發(fā)生交叉反應(yīng)。因此，無論是Lp(a)還是Apo(a)作為抗原制備的抗血清都無法準(zhǔn)確地測定Lp(a)含量。并且，采用提純?nèi)搜宓姆椒ㄖ苽涿庖咴璍p(a)或Apo(a)所需血漿來源困難、社會(huì)供給不足；制備的抗血清不僅會(huì)與LDL或PLG有交叉反應(yīng)，特異性較差；而且，抗血清的效價(jià)也不高。

發(fā)明內(nèi)容

本申請(qǐng)的目的是提供一種全新的制備抗Lp(a)多克隆抗血清的引物，基于該引物的制備抗Lp(a)多克隆抗血清的質(zhì)粒，以及該引物和質(zhì)粒的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本申請(qǐng)的一方面公開了一種用于制備抗Lp（a）多克隆抗血清的引物，該引物包括上游引物和下游引物，上游引物含有Seq ID No.1所示序列，下游引物含有所示序列；

Seq ID No.1：5’-GACATATGAGAAAAGCCCTGTGGTCC-3’

Seq ID No.2：5’-GACTCGAGCCCACAATCAAATGAAGA-3’。