[發(fā)明專利]一種在胰腺組織中特異性表達hDAP基因和DDIT3基因的載體及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410085411.5
• 申請日: 2014-03-10
• 公開（公告）號: CN103882027A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊述林;孔思遠(yuǎn);阮進學(xué);胡炳俊;王超群;程玉柱;李奎
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/85;C12N5/10;A01K67/027
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種在胰腺組織中特異性表達hDAP基因和DDIT3基因的載體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

醫(yī)學(xué)研究需要大量建立與人類疾病病理相關(guān)的動物模型。能夠模擬和體現(xiàn)糖尿病病理生理變化的動物模型將有助于人們更好地理解疾病的本質(zhì)，為糖尿病的預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ)，可為藥物靶點篩選、新藥開發(fā)、高效治療方式的發(fā)現(xiàn)提供試驗對象。

使用基因工程技術(shù)制備小鼠動物模型，對動物模型的基因組加以改造，可通過特定基因的過表達、基因敲除和基因敲入等方法建模，模擬研究人類糖尿病，比其他方法制備的動物模型更理想。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種在胰腺組織中特異性表達hDAP基因和DDIT3基因的載體及其應(yīng)用。

本發(fā)明首先提供了一種DNA分子，包括啟動子、hDAP基因和DDIT3基因，由所述動子啟動所述hDAP基因和所述DDIT3基因的表達；所述啟動子如序列表的序列5自5’末端第21-1505位核苷酸所示；所述hDAP基因編碼序列表的序列7所示的蛋白質(zhì)；所述DDIT3基因編碼序列表的序列9所示的蛋白質(zhì)。

所述hDAP基因位于所述DDIT3基因的上游。

所述hDAP基因和所述DDIT3基因之間具有F-2A序列；所述F-2A序列編碼序列表的序列8所示的蛋白質(zhì)。

所述hDAP基因如序列表的序列5自5’末端第1526-1792位核苷酸所示。

所述DDIT3基因如序列表的序列5自5’末端第1901-2407位核苷酸所示。

所述F-2A序列如序列表的序列5自5’末端第1817-1900位核苷酸所示。

所述DNA分子具體可為如下（a）或（b）：（a）序列表的序列5自5’末端第21-2407位核苷酸所示的DNA分子；（b）序列表的序列5自5’末端第21-2423位核苷酸所示的DNA分子。

含有以上任一所述的DNA分子重組載體、表達盒或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護范圍。所述重組載體具體可為在pGL3-control載體的多克隆位點插入所述DNA分子得到的重組質(zhì)粒。所述重組載體更具體可為將pGL3-control載體Mlu?I和Xba?Ⅰ酶切位點之間的小片段取代為序列表的序列5自5’末端第21-2423位核苷酸所示的DNA分子得到的重組質(zhì)粒。

本發(fā)明還保護以上任一所述的DNA分子或重組載體的應(yīng)用，為如下（1）或（2）或（3）或（4）：（1）制作糖尿病鼠模型；（2）誘發(fā)小鼠發(fā)生胰島素分泌缺陷和胰島素抵抗；（3）制備用于制作糖尿病鼠模型的試劑盒；（4）制備用于誘發(fā)小鼠發(fā)生胰島素分泌缺陷和胰島素抵抗的試劑盒。

所述小鼠具體可為C57BL/6J小鼠。

本發(fā)明通過胰腺特異啟動子啟動hDAP基因和DDIT3基因的表達且使其與胰島素表達的時空特異性保持一致（通過Furin裂解位點和自剪切多肽2A連接實現(xiàn)兩個基因的共表達，兩個基因在一個表達盒內(nèi)，表達避免了應(yīng)用雙啟動子存在啟動子間相互抑制現(xiàn)象可能導(dǎo)致基因表達抑制的弊端，克服了多基因共表達的不均衡性，使基因表達趨于平衡；使用時，可以借助一個重組載體對兩個基因進行轉(zhuǎn)化，也避免了多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中，雙載體轉(zhuǎn)化效率問題和多種抗生素選擇而帶來的困擾），引起小鼠胰島β細(xì)胞啟動凋亡應(yīng)激相關(guān)通路，進而使胰島β細(xì)胞數(shù)量減少，導(dǎo)致胰島素分泌絕對不足，產(chǎn)生糖耐量低減，最終很可能出現(xiàn)小鼠空腹血糖持續(xù)走高，發(fā)生糖尿病，達到建模目的。

附圖說明

圖1為質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為實施例2中對照組轉(zhuǎn)染48小時后的照片。

圖3為實施例2中hDAP基因的相對表達量和DDIT3基因的相對表達量。

圖4為實施例3中的瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖5為實施例3中的Southern雜交結(jié)果。

圖6為實施例3中部分樣本的電泳圖。

圖7為實施例3中的Western雜交圖。

圖8為實施例3中熒光定量PCR鑒定DDIT3基因的相對表達量。

圖9為實施例3中實驗組飼喂27周高脂高糖飼料后進行糖耐量測定的結(jié)果。

圖10為實施例3中對照組飼喂37周正常飼料后進行糖耐量測定的結(jié)果。

具體實施方式