[發明專利]生產具有纖維素內切酶和葡糖苷酶雙活性蛋白的酵母菌株及其構建

有效

• 申請號: 201410084775.1
• 申請日: 2014-03-10
• 公開（公告）號: CN103820443A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 薛棟升;汪江波;周敏
• 申請（專利權）人: 湖北工業大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 張火春

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技術領域

本發明屬于酶工程領域，具體涉及一種生產具有纖維素內切酶和葡糖苷酶雙活性蛋白的酵母菌株及其構建。

背景技術

纖維素是地球上最豐富的可再生資源，地球上每年因光合作用產生的纖維素達到100億噸左右，利用纖維素生產生物能源，是緩解能源危機，實現人類可持續發展的關鍵。

纖維素利用的關鍵是把纖維素降解為可發酵性的糖類-葡萄糖。纖維素的降解需要外切酶、內切酶、葡糖苷酶的共同作用。其中內切酶降解長片段的纖維素成為二聚體，是纖維素降解的關鍵步驟。用纖維素酶降解纖維素具有綠色、條件溫和、轉化率高的特點，但是纖維素酶較高的生產成本成為纖維素酶降解纖維素的瓶頸。

降低纖維素酶成本一個有效的方法是提高酶的利用效率。由于纖維素的降解需要三種酶的協同作用，具有兩種功能或多種功能的蛋白能顯著地提高纖維素酶的利用效率，從而降低纖維素酶工業化利用的成本。同時纖維素酶的穩定性越好，纖維素酶能更長時間的降解纖維素，因此具有更大的應用價值。

發明內容

本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種生產具有纖維素內切酶和葡糖苷酶雙活性蛋白的酵母菌株。

本發明的另一目的在于提供用于構建上述酵母菌株的DNA片段。

本發明的再一目的在于提供用于構建上述酵母菌株的質粒。

本發明的目的還在于提供上述酵母菌株的構建方法。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

用于構建生產具有纖維素內切酶和葡糖苷酶雙活性蛋白的酵母菌株的DNA片段，包括按順序排列的釀酒酵母TDH3啟動子序列、釀酒酵母分泌信號肽編碼序列、具有纖維素內切酶和葡糖苷酶活性的序列、釀酒酵母TDH3終止子序列；上述序列分別如SEQ?ID?NO.1～4所示。

優選的，所述的用于構建生產具有纖維素內切酶和葡糖苷酶雙活性蛋白的酵母菌株的DNA片段的序列如SEQ?ID?NO.5所示。

用于構建生產具有纖維素內切酶和葡糖苷酶雙活性蛋白的酵母菌株的質粒為包含上述DNA片段的真核表達質粒。所述的真核表達質粒優選為pPIC9K質粒。

所述的用于構建生產具有纖維素內切酶和葡糖苷酶雙活性蛋白的酵母菌株的質粒優選通過包含如下步驟的方法制備得到：合成兩端有限制性內切酶識別位點含有上述DNA片段的序列，通過限制性內切酶連接到真核表達質粒上。所述的真核表達質粒為pPIC9K質粒時，限制性內切酶優選為AatⅡ和NotⅠ。

一種生產具有纖維素內切酶和葡糖苷酶雙活性蛋白的酵母菌株，含有上述質粒。所述的酵母菌株優選為酵母菌株SMD1168。

所述的生產具有纖維素內切酶和葡糖苷酶雙活性蛋白的酵母菌株的構建方法，包括如下步驟：制備酵母電轉化感受態細胞，將上述質粒通過電轉化轉進酵母中得到。

本發明相對于現有技術具有如下優點和效果：

本發明構建了一個有纖維素內切酶和葡糖苷酶雙活性的蛋白。同時，本發明把具有纖維素內切酶和葡糖苷酶活性的蛋白在酵母菌中實現了高效表達，纖維素內切酶和葡糖苷酶的活性達1.2?U/mL和0.3?U/mL，進一步降低了纖維素酶的工業化利用成本。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明做進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。

實施例1

A、大腸桿菌pPIC9K質粒提取

（1）接1%含pPIC9K質粒的大腸桿菌細胞于2?mL?LB培養基。?

（2）37?℃振蕩培養12?h。

（3）取1.5?mL菌體于EP管，以4000?rpm離心3?min，棄上清液。?

（4）加0.l?mL溶液I（1%葡萄糖，50?mM?EDTA?pH?8.0，25?mM?Tris-HCl?pH?8.0）充分混合。?

（5）加入0.2?mL溶液II（0.2?mM?NaOH，1%?SDS），輕輕翻轉混勻，置于冰浴5?min。?

（6）加入0.15?mL預冷溶液III（5?mol/L?KAc，pH4.8），輕輕翻轉混勻，冰浴5?min。

（7）以10000?rpm離心20?min，取上清液于另一新EP管。

（8）加入等體積的異戊醇，混勻后靜置10?min。?

（9）再以10000?rpm離心20?min，棄上清。?

（10）用70%乙醇0.5?mL洗滌一次，抽干所有液體。

（11）待沉淀干燥后，溶于0.05?mL?TE緩沖液中。

B、pPIC9K-END質粒構建