[發明專利]一種豬HEV總抗體ELISA檢測試劑盒的制備方法

有效

• 申請號: 201410084515.4
• 申請日: 2014-03-07
• 公開（公告）號: CN103837680A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發明（設計）人: 蘭喜;楊彬;常曉依;柳紀省;張韻;殷相平;李寶玉;李學瑞;李志勇;方玉萍
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: G01N33/576
• 分類號: G01N33/576;C12N15/51;C12N15/70;C07K14/08
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種豬HEV總抗體ELISA檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，該豬HEV總抗體ELISA檢測試劑盒的制備方法包括以下步驟：

第一步，HEV包被抗原的制備：

首先PCR擴增豬源swCH189株HEV?ORF2基因部分的兩個片段，上下游引物分別帶有BamH?Ⅰ和Not?Ⅰ酶切位點；

FS為S片段上游引物，帶有BamH?Ⅰ酶切位點，RS為片段下游引物，帶有Not?Ⅰ酶切位點；FP12為P12片段上游引物，帶有BamH?Ⅰ酶切位點，RP12為片段下游引物，帶有Not?Ⅰ酶切位點；

PCR片段擴增后回收，采用BamH?Ⅰ和Not?Ⅰ雙酶切，連接到pMD18-T載體，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，挑取轉化子，小提質粒，用BamH?Ⅰ和Not?Ⅰ酶切鑒定，鑒定陽性克隆分別命名為T-S和T-P12；

將pET32a（+）與鑒定的克隆質粒分別以BamH?Ⅰ/Not?Ⅰ進行消化，進行瓊脂糖電泳，膠回收目的片段后進行連接，構建可在大腸桿菌中表達的重組質粒，命名pET-S和pET-P12，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，挑取轉化子，小提質粒，用BamH?Ⅰ和Not?Ⅰ限制性內切酶進行酶切鑒定；

陽性重組質粒pET-S和pET-P12轉化Rossetta(DE3)感受態細胞，挑選單克隆菌落于氨芐西林鈉LB培養液中培養10h，菌液以1:100的比例加入到1L含100μg/ml氨芐西林鈉的LB培養基37℃振蕩培養至OD600=0.8，加入終濃度為0.5mmol/L的IPTG，25℃誘導5h，4℃6000r/min離心15分鐘收集菌體，菌體采用20ml1%TritonX-100的PBS懸浮，超聲波破碎，4℃12000r/min離心30分鐘，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE，分析確定表達產物在大腸桿菌的存在形式，結果發現重組蛋白以包涵體的形式存在；

目的蛋白進行SDS-PAGE，條帶與預期大小相一致，命名為S蛋白，純化后的S蛋白為包被抗原；

第二步，HEV標記抗原的制備：

將陽性克隆pET-P12于Amp+LB培養液中培養10h，菌液以1:100的比例加入到1L含100μg/ml氨芐西林鈉的LB培養基37℃振蕩培養至OD600=0.8，加入終濃度為1mmol/L的IPTG，25℃誘導5h，4℃6000r/min離心15分鐘收集菌體，菌體采用20ml1%Triton?X-100的PBS懸浮，超聲波破碎，4℃12000r/min離心30分鐘，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE，確定表達產物以包涵體的形式存在于沉淀，進行蛋白的純化，純化得到的蛋白命名為P12蛋白，為標記蛋白；

第三步，HEV標記抗原-HRP標記物的制備，具體包括：

步驟一，HEV標記抗原和HRP的偶聯采用NaIO₄氧化法，首先將純化蛋白P12于PBS溶液中4℃透析過夜；

步驟二，紫外分光光度計測定純化蛋白濃度；

步驟三，分析天平秤取HRP10mg溶于2ml超純水中制備終濃度為5mg/ml的HRP溶液，分析天平秤取NaIO₄，溶于超純水中制備終濃度為20mg/ml的NaIO₄溶液備用；

步驟四，緩慢滴加225μl?NaIO₄溶液于2ml?HRP溶液中，室溫下避光靜置20分鐘；

步驟五，加入20μl乙二醇于HRP混合溶液中，之后室溫下靜置30分鐘；

步驟六，取1ml2.1mg/ml的標記蛋白P12緩慢逐滴加入到活化好的HRP溶液中；

步驟七，然后將P12蛋白-HRP結合物分別于50mM?CB?pH9.6的溶液中4℃避光透析2.5個小時；

步驟八，分析天平稱量NaBH4溶于水中，制備終濃度為4mg/ml的NaBH₄溶液；

步驟九，將透析袋取出，加入162μl的NaBH₄溶液；

步驟十，室溫下在搖床上輕輕震動2個小時；

步驟十一，標記物在PBS溶液中4℃透析過夜；

步驟十二，透析結束后1：1比例加入甘油，-20度保存，此標記物下文稱為HRP-P12；

第四步，采用碳酸鹽緩沖液以一定比例將S抗原稀釋，100μl/孔加入到酶標板，4℃包被過夜，次日采用PBST(10mM?PB，150mM?NaCl，0.05%Tween-20，pH7.4)洗滌液洗板三次，最后一次拍干，150μl/孔加入含30%新生牛血清，8%蔗糖，5%牛血清白蛋白，150mM?NaCl的ρΗ7.4，10mM?PB封閉液，4℃封閉12小時，次日甩掉孔內液體，拍干，置室溫20-25℃、濕度20%-25%、有通風設備的干燥房間內風干過夜，封裝于加有干燥劑的鋁膜袋中，包被完畢。