[發明專利]一種新型單糖熒光衍生方法和應用

有效

• 申請號: 201410083915.3
• 申請日: 2014-03-07
• 公開（公告）號: CN104592207B
• 公開（公告）日: 2017-06-06
• 發明（設計）人: 約瑟夫·弗戈邁爾;劉麗;蔡志鵬;安德魯·黑根
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C07D405/04
• 分類號: C07D405/04;C09K11/06;G01N21/64
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司32218
• 代理人: 徐冬濤,呂鵬濤

技術領域

本發明涉及一種新的熒光衍生試劑及其使用方法，并涉及將其應用于生物樣品的單糖組分分析。

背景技術

隨著科學研究的發展，人們逐漸認識到由不同單糖組成的糖鏈是除蛋白質和核酸外體現生命現象的第三類生物大分子，糖鏈的研究已被公認為繼蛋白質和核酸的研究后探索生命奧秘的第三個里程碑。

糖鏈在生物體內發揮著重要作用，如細胞識別，細胞相互作用，炎癥和疾病惡化等。另外，糖鏈是很多病毒、細菌等的受體，并作為腫瘤的標記物受到越來越多的關注。

然而，由于糖鏈結構的復雜性和多樣性，其研究進展遠遠落后于蛋白質和核酸的研究，而單糖組分研究是深入研究糖鏈結構和功能的第一步。由于糖分子本身不具有（或只具有極弱的）發光性，人們通常先將糖進行化學衍生標記，使其具有較強的紫外或熒光吸收，然后經高效液相色譜或毛細管電泳等技術進行進一步解析。

目前，人們已經開發出多種單糖衍生標記化合物如2-氨基吡啶（2-PA）、2-鄰氨基苯甲酸（2-AA）和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）等，但這些方法都存在著一定局限性：如使用2-PA時需要過葡聚糖凝膠柱除去過量的2-PA，這使得樣品準備需要大量的時間以及造成樣品損失；使用2-AA標記葡糖胺時，會有15%的葡糖胺異構成甘露糖胺；而PMP標記時也需要經過多次乙醚萃取除去過量PMP，并且PMP標記的糖定量效果不可靠。基于以上原因有必要開發出一種能夠避免上述缺陷的新的糖熒光衍生方法。

發明內容

本發明的目的是在現有技術的基礎上，提供一種新的熒光衍生試劑。本發明所使用的化學衍生物本身不具有熒光特性，與還原糖發生化學反應后能夠使糖具有熒光特性，因此反應后無須去除多余的衍生物從而可以快速地進行HPLC分析，此外此方法可實現對糖的定量分析。

本發明的另一目的是提供一種將上述熒光衍生試劑應用于單糖組分分析的方法。

本發明的目的可以通過以下措施達到：

式（I）所示的非熒光化合物在作為還原糖的熒光衍生試劑方面的應用，

其中，Ar為雜芳基，優選的Ar為吡啶基、嘧啶基、喹啉基、異喹啉基或吡唑啉基，最優選為吡啶基。

本發明包括一種單糖熒光衍生方法，將一種或多種還原糖，或者含有一種或多種還原糖的溶液，與堿和式（I）所示的非熒光化合物進行縮合和環化脫水反應，得到用于單糖結構定性或定量檢測的熒光標記產物；所述還原糖選自己糖、己糖衍生物、戊糖或戊糖衍生物中的一種或幾種。

本發明所適用的還原糖包括己糖和戊糖，以及被修飾的己糖和戊糖。如C3，C4，C5和C6位置上的羥基有一個或多個被R基取代的還原糖。進一步的，本發明的還原糖選自式（II）或式（III）化合物中的一種或幾種，

其中，R₁、R₂、R₃或R₄分別獨立地選自氫、羥基、氨基、乙酰基、羧基、磷酸基、鹵素、硫酸基或糖基。

優選的，R₁、R₂或R₄分別獨立地選自羥基，R₃選自氫或羥基；進一步優選的，還原糖選自半乳糖、甘露糖、古洛糖、甘露糖、阿拉伯糖、芹菜糖、木糖、巖藻糖或鼠李糖中的一種或幾種。

本發明中的堿為碳酸氫鈉或碳酸氫鉀，堿的用量為還原糖總質量的0.1～1倍，具體可根據反應進行調整；反應溶液選自水和/或甲醇；反應溫度為50～130℃。本發明得到的熒光標記產物的激發波長為300-600nm，吸收波長為360-650nm。

在本發明中，采用新的熒光衍生試劑，還原糖與其活潑亞甲基經縮合并進一步經分子內環化脫去一分子水形成熒光標記產物。其反應原理如下：

本發明進一步提供了一種單糖熒光衍生測定方法：將一種或多種還原糖，或者含有一種或多種還原糖的溶液，與堿和式（I）所示的非熒光化合物進行縮合和環化脫水反應，得到熒光標記產物，采用HPLC方法以激發波長300-600nm、吸收波長360-650nm進行測定得到的標記產物。其中各反應原料和條件如上所述。

本發明的有益效果：

本發明所使用的熒光衍生試劑不具有熒光特性，與還原糖發生化學反應后能夠使糖具有熒光特性，因此反應后無須去除多余的衍生物從而可以快速地進行HPLC分析，此外，此方法中衍生物能夠與糖進行分子量1：1的反應從而實現對糖的定量分析。

附圖說明