[發明專利]靶向性抗腫瘤融合蛋白質LPO的新型制備工藝

有效

• 申請號: 201410082515.0
• 申請日: 2014-03-08
• 公開（公告）號: CN103805621A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 張國利;史飛;于佳;何苗;田園;于新海;劉雨玲;吳廣謀;岳玉環
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/70;C07K19/00;A61P35/00
• 代理公司: 長春市東師專利事務所 22202
• 代理人: 張鐵生

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體地說是靶向性抗腫瘤融合蛋白質LPO的新型制備工藝。

背景技術

惡性腫瘤（癌癥）業已成為人類生命的最大殺手。世界衛生組織最新研究數據顯示，到2020年全球癌癥發病率將增加50%，即每年將新增1500萬癌癥患者。不僅如此，癌癥的死亡人數也在全球迅猛上升。2007年全球有760萬人死于癌癥，預計2030年這個數字將會增加到1320萬，據國家衛生部發布的權威報告稱我國新發癌癥和因癌癥死亡病例數分別占全球的20%和24%。所以，惡性腫瘤的治療成為當今醫學的重要任務之一。

??核糖核酸酶(RNase)普遍存在于自然環境和人體內，它們可以通過降解細胞內的核糖核酸而殺死細胞。肝臟細胞內大約含?20余種核酸內切酶和外切酶，它們參與?RNA代謝、細胞成熟及凋亡、促進新生血管形成、主動防御?RNA病毒等生物學作用。盡管核糖核酸酶大量存在，但由于核糖核酸酶抑制劑(RI)的抑制作用，體內的RNase并未對組織細胞造成傷害。

RNase?A超家族主要成員有?RNase?A、人胰臟核糖核酸酶、嗜曙紅細胞衍生神經毒素、嗜曙紅陽離子蛋白、血管生成因子、牛精液核糖核酸酶和兩棲類核糖核酸酶（如豹蛙酶和牛蛙凝集素）等。RNase?A超家族通過降解?RNA發揮作用，其家族成員具有相似的氨基酸序列和三級結構，一般含有?4對二硫鍵（血管生成因子含有?3對二硫鍵），并且都含有相同的催化三聯體，包括?2個組氨酸和?1個賴氨酸。由于該家族的許多成員來源于人或哺乳動物，它們的免疫原性要比來源于植物或微生物的毒素復合物低。

在十九世紀70年代時，Shogen和Yoon最先在北極豹蛙的胚胎內分離提出一些帶有抗癌活性的提取物。于1987年，提取物的主要活性成分被Alfacell?M分離并且純化出來。那些活性物質是一種小的（大約12kDa）母性起源（目前大量存在于未受精的卵母細胞中）的堿性蛋白。被稱為豹蛙酶（ranpimase），后來正式命名為Onconase（簡稱ONC），它由?104個氨基酸殘基組成，相對分子質量為?11835Da，等電點為?9.7，其序列與胰臟核糖核酸酶A（RNase?A，EC?3.1.27.5）和核糖核酸酶超A家族的其他成員十分的相似，與RNase?A有30%的堿基序列同源，并且三級結構相似，是已知的胰核糖核酸酶超家族成員中最小的單結構域蛋白。單就核糖核酸酶活性而言，RNase?A要高于豹蛙酶和牛精液核糖核酸酶(BS-RNase)，但由于受到?RI的抑制，RNase?A對腫瘤細胞沒有殺傷效果；兩棲類動物體內的?RNase?A由于可以避開?RI，故有殺傷腫瘤細胞作用。尤其是豹蛙酶，是首個進入Ⅲ期臨床研究的核糖核酸酶類藥物，主要用于治療惡性間皮瘤，目前治療非小細胞肺癌的研究也已經進入了臨床Ⅱ期試驗階段。

ONC與已知的RNase?A結構相似，由?2個反向平行的?β片層和?3個?α螺旋結構組成了的腎形核結構，其酶活性中心是一個保守的催化三聯體。Robert?F.?Gahl等人在試驗中發現ONC氧化折疊過程中會形成穩定的中間體，這樣可以保持它的有效活性形式。Daniel?E.?Holloway等報告了在100K電場和復雜硫酸根離子中，?ONC的晶體結構，在一個質量足夠大的電子密度圖中明顯的顯示出了幾個非平面的肽鍵，可以非常容易確定其活性中心的大多數殘基。

為了確定ONC蛋白質中負責毒性的氨基酸殘基，You-Di?Liao等人從染色體組克隆豹蛙的rpr基因，并在大腸桿菌BL21（DE3）中進行了多種形式的表達?。表達方法一：將甲硫氨酸排列在ONC重組體的N-末端，結果發現該重組蛋白熱穩定性減小且催化活性和抗原性降低。他們利用依賴內源性大腸桿菌甲硫氨酸氨基肽酶和apelB信號肽切割兩種方式生產了沒有甲硫氨酸的ONC，發現重組蛋白與天然來源的ONC的物理、化學、生物特性基本相符。同時證明在ONC?的N-末端具有尿苷-鳥嘌呤底物偏愛性的焦谷氨酸，完整且外露的N-末端焦谷氨酸對豹蛙酶的細胞毒性有較大的幫助作用。