[發(fā)明專利]一種基于抗EGFR單鏈抗體及精氨酸九聚體的融合蛋白與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410081527.1
• 申請(qǐng)日: 2014-03-06
• 公開（公告）號(hào): CN103910799A
• 公開（公告）日: 2014-07-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 任新玲;陸遠(yuǎn);劉莉;張瑞;王媛;馬進(jìn);張艱;李圣清;李志奎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K16/28
• 分類號(hào): C07K16/28;C12N15/62;G01N33/68;A61K39/395;A61K47/42;A61P35/00
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司 61200
• 代理人: 蔡和平

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于抗腫瘤技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于抗EGFR單鏈抗體及精氨酸九聚體的融合蛋白與應(yīng)用。

背景技術(shù)

表皮生長因子受體（EGFR）家族是一類跨膜蛋白受體，具有酪氨酸激酶活性，通過調(diào)節(jié)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。膠質(zhì)細(xì)胞、腎癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等組織中都有EGFR的過表達(dá)。EGFR的高表達(dá)對(duì)一些惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期、侵襲及新生血管形成等方面起關(guān)鍵作用（Mendelsohn?J,J?Clin?Oncol,2003,21(14):2787-2799），EGFR成為抗腫瘤藥物或者疫苗的重要靶點(diǎn)。

EGFR在腫瘤中高表達(dá)以及其在腫瘤生長分化中起的重要作用，使其成為腫瘤診斷、抗腫瘤治療的重要靶點(diǎn)。目前，研發(fā)抑制惡性腫瘤中EGFR高表達(dá)的藥物已成為治療惡性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要手段之一。然而，在EGFR抑制劑研發(fā)中，雖有吉非替尼、西妥昔單抗等已被應(yīng)用于臨床，但療效并非理想，其它一些生物抑制劑仍處于基礎(chǔ)研究和臨床研究階段。同時(shí)，以EGFR作為靶點(diǎn)，尋找抑制惡性腫瘤中EGFR高表達(dá)的藥物是研發(fā)抗腫瘤新藥或類似化合物的重要途徑之一。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明解決的問題在于提供一種基于抗EGFR單鏈抗體及精氨酸九聚體的融合蛋白與應(yīng)用，達(dá)到對(duì)腫瘤細(xì)胞起到特異性的殺傷作用，且毒副作用小。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

一種基于抗EGFR單鏈抗體及精氨酸九聚體的融合蛋白，包括通過連接肽相連接的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，輕鏈可變區(qū)的末端連接有精氨酸九聚體；其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

一種編碼基于抗EGFR單鏈抗體及精氨酸九聚體的融合蛋白的核苷酸，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

一種基于抗EGFR單鏈抗體及精氨酸九聚體的融合蛋白的制備方法，包括以下操作：

1）將如SEQ.ID.NO.4所示的核苷酸克隆入pGEX4T-1表達(dá)載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒；

2）將所構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌，并在含氨芐青霉素的YTA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時(shí)，添加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集誘導(dǎo)后的菌液離心，收集細(xì)菌后破菌、離心，收集上清；

3）使用GST親和層析柱純化分離上清中的融合蛋白，得到基于抗EGFR單鏈抗體及精氨酸九聚體的融合蛋白。

一種抗EGFR單鏈抗體，包括通過連接肽相連接的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

一種編碼抗EGFR單鏈抗體的核苷酸，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

所述的融合蛋白在制備抗腫瘤藥物、抗腫瘤輔助藥物或腫瘤診斷試劑中的應(yīng)用。

所述的融合蛋白在制備靶向EGFR的藥用載體、攜帶載體中的應(yīng)用。

所述的應(yīng)用，包括所述的融合蛋白在攜帶siRNA、microRNA、脂質(zhì)體中的一種或幾種進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部并釋放的應(yīng)用。

所述的核苷酸在構(gòu)建表達(dá)載體，以及制備抗腫瘤藥物、抗腫瘤輔助藥物或腫瘤診斷試劑中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

本發(fā)明提供的基于抗EGFR單鏈抗體及精氨酸九聚體的融合蛋白，采用經(jīng)過篩選的連接肽連接單鏈的EGFR抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，既保留了抗體與EGFR結(jié)合的特異性和親和力，保證了所構(gòu)建的融合蛋白對(duì)EGFR的靶向性；而且降低了融合蛋白的大小，一方面既方便其構(gòu)建、表達(dá)和純化，實(shí)現(xiàn)了其低成本的獲取，另一方面保證了其對(duì)EGFR結(jié)合、尤其是內(nèi)化入細(xì)胞對(duì)分子大小、抗體活性的要求，確保了其對(duì)EGFR結(jié)合、靶向腫瘤細(xì)胞內(nèi)化的可行性和準(zhǔn)確性。

進(jìn)一步的，精氨酸九聚體是一種連續(xù)的由9個(gè)精氨酸構(gòu)成的短肽，作為內(nèi)化工具可以使多肽、多聚核苷酸、脂質(zhì)體等極小微粒進(jìn)入細(xì)胞。通過與單鏈抗體融合表達(dá)，可以將抗腫瘤的物質(zhì)靶向輸送到腫瘤所在部位，并內(nèi)化入腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤的治療作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其具有免疫原性和靶向性，而且內(nèi)化性效果良好。

本發(fā)明提供的在大腸桿菌中表達(dá)的基于抗EGFR單鏈抗體及精氨酸九聚體的融合蛋白，可以利用單鏈抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性和精氨酸九聚體的內(nèi)化作用，協(xié)同其他抗腫瘤分子，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞起到特異性的殺傷作用，效果明顯，且毒副作用小，制備簡單方便，有良好的應(yīng)用前景，為腫瘤的治療提供了一種新的選擇。