[發(fā)明專利]一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410081508.9
• 申請(qǐng)日: 2014-03-07
• 公開（公告）號(hào): CN103866016A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 樊嘉;楊欣榮;郭偉;孫云帆;周儉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 翁若瑩

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

近年來肝細(xì)胞癌的發(fā)病率和死亡率迅速上升，躍居惡性腫瘤第五位。雖然治療技術(shù)有了很大的提高，但5年生存率沒有明顯改善，約50％的患者在術(shù)后5年發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，預(yù)測(cè)肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)以便早期進(jìn)行必要的干預(yù)是進(jìn)一步改善肝癌預(yù)后的關(guān)鍵。臨床迫切需要一種有效、可靠的檢測(cè)技術(shù)解決疾病早期診斷、高風(fēng)險(xiǎn)復(fù)發(fā)的篩查、抗腫瘤治療的效果評(píng)價(jià)、預(yù)防并控制遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等HCC治療中所面臨的難題。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)是指有原發(fā)腫瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移灶釋放入外周血的腫瘤細(xì)胞，在健康人體內(nèi)極為罕見。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，循環(huán)腫瘤細(xì)胞在惡性腫瘤形成早期即可釋放入血。循環(huán)腫瘤細(xì)胞由原發(fā)灶釋放進(jìn)入血液循環(huán)，是惡性腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。因此，CTC檢測(cè)被認(rèn)為是一種新的診斷技術(shù)，一項(xiàng)新的預(yù)后評(píng)價(jià)工具、一項(xiàng)有效的惡性腫瘤治療應(yīng)答的預(yù)測(cè)指標(biāo)，在臨床應(yīng)用中被寄予極高期望。CTC的檢測(cè)有助于早期腫瘤患者的診斷、術(shù)后患者監(jiān)測(cè)腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移、評(píng)估抗腫瘤藥物的敏感性與患者預(yù)后以及選擇個(gè)體化的治療策略。

一般而言，CTC檢測(cè)的方法大致可以分為細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)和基于核酸檢測(cè)的技術(shù)兩類，通常都包括富集和檢測(cè)兩個(gè)步驟。由于CTC在外周血中數(shù)量稀少，通過富集細(xì)胞來提高檢測(cè)的敏感性很有必要。

CTC富集技術(shù)主要分為以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)的富集和以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的富集。前者，主要依靠細(xì)胞密度梯度進(jìn)行分離，操作步驟較繁瑣，分離效果不佳。后者是基于細(xì)胞表面抗原分子能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場(chǎng)的作用下，通過抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸引而滯留在磁場(chǎng)中，而其它細(xì)胞因?yàn)椴粠Т判裕荒茉诖艌?chǎng)中停留，從而使細(xì)胞得以分離。其中，較具代表性的方法是磁性活化細(xì)胞分選系統(tǒng)(magnetic?activated?cell?sorting?system，MACS)，采用胞膜或胞內(nèi)染色(后者需要透膜化及固定)，然后通過免疫磁性標(biāo)記的微球來捕獲CTC。MACS方法分離效果優(yōu)于細(xì)胞密度梯度法，但操作仍較復(fù)雜。

常用的CTC檢測(cè)技術(shù)有流式細(xì)胞術(shù)(flow?cytometry，F(xiàn)CM)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse?transcriptase?polymerase?chain?reaction，RT-PCR)。RT-PCR技術(shù)因其操作簡(jiǎn)單、可標(biāo)記物選擇多、特異性好等特點(diǎn)而應(yīng)用較多。

目前商業(yè)化CTC富集和檢測(cè)相結(jié)合的技術(shù)主要有Cell?Search、Epithelial?immunospot(EPISPOT)、CTC-chip等。其中，Cell?Search是目前美國(guó)食品和藥品管理局(Food?and?DrugAdministration，F(xiàn)DA)唯一批準(zhǔn)的檢測(cè)CTC的方法。但是，Cell?Search檢測(cè)價(jià)格昂貴、標(biāo)本用量大(7.5ml)，選用EpCAM作為標(biāo)志物篩選(陽(yáng)選法)CTC會(huì)對(duì)細(xì)胞表面不表達(dá)EpCAM的CTC造成漏檢，且存在CTC數(shù)量少時(shí)檢測(cè)重復(fù)性差、結(jié)果判斷主觀性強(qiáng)等缺點(diǎn)。EPISPOT是一種基于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定原理的免疫學(xué)分析方法，基于陽(yáng)選法的富集原理和Cell?Search存在類似的缺點(diǎn)。CTC-chip作為一種全新的芯片技術(shù)，具有靈敏度高、特異性好的優(yōu)點(diǎn)，但需要特殊的檢測(cè)設(shè)備，且檢測(cè)成本很高，不適合高通量檢測(cè)。因此，臨床上迫切需要一種特異性高、靈敏度高；通量高；成本低、高效且操作簡(jiǎn)單的CTC富集和檢測(cè)技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)試劑盒，利用陰性富集方法最大限度的去除外周血中白細(xì)胞來富集循環(huán)中的微量腫瘤細(xì)胞，而后通過微量核酸提取及合成技術(shù)提取富集腫瘤細(xì)胞的RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，最后通過高靈敏的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)完成腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包含RosetteSep稀有細(xì)胞富集試劑、RNA抽提試劑、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑、熒光標(biāo)記Taqman探針、特異性引物和qPCR反應(yīng)體系試劑。

本發(fā)明提供了一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)方法，其特征在于，具體步驟包括：

應(yīng)用RosetteSep稀有細(xì)胞富集技術(shù)(RosetteSep?applied?imaging?rare?event，RARE)富集5ml外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞；抽提總RNA并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；采用熒光標(biāo)記Taqman探針qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面至少一個(gè)干性細(xì)胞標(biāo)志物。

所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)方法使用上述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)試劑盒。