[發(fā)明專利]5-Aza-CdR在上調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中RASSF1A基因表達(dá)的應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410081347.3
• 申請日: 2014-03-07
• 公開（公告）號: CN103989697A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 臧曉方;周勇;熊軍;肖智
• 申請（專利權(quán)）人: 臧曉方;周勇
• 主分類號: A61K31/706
• 分類號: A61K31/706;A61P35/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物和藥物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及5-Aza-CdR在上調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中RASSF1A基因表達(dá)的應(yīng)用。

背景技術(shù)

骨肉瘤在原發(fā)性惡性骨腫瘤中屬于最常見的一種類型，多見于青少年和年輕成人，在兒童腫瘤中約占5％。盡管在早期診斷和綜合治療上獲得了很大進(jìn)步，但是骨肉瘤患者的五年生存率仍然只能達(dá)到60％左右。骨肉瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素和多階段的過程癌基因激活和抑癌基因失活共同導(dǎo)致了其表型的變化。近幾年來發(fā)現(xiàn)DNA甲基化狀態(tài)水平的改變成為腫瘤相關(guān)抑癌基因功能失活的一個(gè)重要分子機(jī)制。有學(xué)者在研究骨肉瘤細(xì)胞時(shí)通過對骨肉瘤組織細(xì)胞中RASSF1A的甲基化的狀態(tài)進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤細(xì)胞中RASSF1A的啟動(dòng)子CpG島區(qū)域的CpG序列也處于高甲基化狀態(tài)。

腫瘤細(xì)胞的高甲基化狀態(tài)水平可以通過甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR的去甲基化作用逆轉(zhuǎn)，甲基化轉(zhuǎn)移酶的這種去甲基化效應(yīng)為腫瘤疾病的臨床治療帶來了新的希望和契機(jī)，部分研究發(fā)現(xiàn)在治療有些白血病危象和頑固性急性白血病時(shí)甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑的效果顯著，但是甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑的具體作用機(jī)制及其在骨肉瘤等疾病中的治療作用尚不清楚。在骨肉瘤細(xì)胞株MG63中，甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR對RASSF1A基因的表達(dá)水平以及對細(xì)胞生長增殖的影響如何有待進(jìn)一步研究，未見有相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種上調(diào)骨肉瘤細(xì)胞系MG63中抑癌基因RASSF1A的mRNA及蛋白表達(dá)的方法，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，擬采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明一方面涉及甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR在上調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中RASSF1A基因表達(dá)的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的骨肉瘤細(xì)胞系為骨肉瘤細(xì)胞系MG63。

在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的骨肉瘤細(xì)胞系為離體骨肉瘤細(xì)胞系。

在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR在同時(shí)增加抑癌基因RASSF1A的mRNA濃度中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的應(yīng)用是非診斷目的和非治療目的的。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1材料

1.1細(xì)胞及抗體：

目的細(xì)胞MG-63(人成骨肉瘤細(xì)胞)由長沙贏潤生物技術(shù)有限公司提供。

RASSF1a抗體購自Abcam，貨號ab23950。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.15-Aza-CdR對MG63細(xì)胞生長影響的研究：

取生長良好的細(xì)胞分16組，分別用不同劑量(0、5、10、50μmol/L)的5-Aza-CdR處理，分別處理(24h、48h、72h、96h)后，MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖情況。

2.25-Aza-CdR處理后RASSF1A的mRNA的表達(dá)變化情況：

收集細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞計(jì)數(shù)后將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，密度為5×10⁵個(gè)/皿，分別予以(0、5、10、50μmol/L)的5-Aza-CdR處理，固定干預(yù)時(shí)間點(diǎn)72h，依此收集細(xì)胞，抽提樣品總RNA行逆轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA，cDNA為模板，分別擴(kuò)增RASSF1a及GAPDH內(nèi)參片段，其中引物對：

RAS-399-f：5’-AACGTGGACGAGCCTGTGGAGT-3’

RAS-399-r：5’-ACGCTCAGCGCGCTCAAAGA-3’

product：Length＝399bp，Ta＝58.7

GAPDH-452-f：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’

GAPDH-452-r：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’

product：Length＝452bp，Ta＝58

取PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠中電泳20min后，在凝膠成像分析系統(tǒng)下顯影照相存檔。通過使用影像分析儀對凝膠進(jìn)行照相并做灰度掃描分析，獲取每個(gè)樣品中PCR產(chǎn)物的灰度值，結(jié)果以與相對應(yīng)樣品GAPDH帶灰度值的比值表示。

2.35-Aza-CdR處理后RASSF1a蛋白的表達(dá)變化情況：