[發(fā)明專利]6?植酸酶的特異性分離純化方法

有效

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• 申請日: 2014-03-06
• 公開（公告）號: CN104894082B
• 公開（公告）日: 2018-03-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 關(guān)瀟;李俊生;潘衛(wèi)東;王敏;劉茂華
• 申請（專利權(quán)）人: 中國環(huán)境科學(xué)研究院
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11002
• 代理人: 王文君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物制品分離純化技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種6-植酸酶的特異性分離純化方法。

背景技術(shù)

植酸酶廣泛存在于植物、動(dòng)物組織和微生物中。植酸酶分為3類：肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶，肌醇六磷酸-6-磷酸水解酶和非特性的正磷酸鹽單酯磷酸水解酶。目前來源于植物的植酸酶均屬于6-植酸酶，最適pH范圍在5.0-7.5之間。而3-植酸酶主要由霉菌、酵母和細(xì)菌產(chǎn)生，最適pH范圍在2.5-5.5之間，適合在單胃畜禽酸性的胃中起作用。因此，從應(yīng)用的角度出發(fā)，飼用植酸酶均為最適pH值為酸性、酶含量較高的微生物來源的3-植酸酶。

作為有益于動(dòng)物營養(yǎng)和改善人類生存環(huán)境的第二代轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品，轉(zhuǎn)植酸酶基因的作物可使植物性飼料中磷的利用率大大提高，動(dòng)物糞便中磷的排出量減少，從而減少飼料中無機(jī)磷的添加量，降低飼料成本,減少高磷糞便造成的環(huán)境污染，還可降低植酸磷的抗?fàn)I養(yǎng)作用，對提高畜牧生產(chǎn)效益及降低其對環(huán)境的磷污染有重要意義。

目前轉(zhuǎn)植酸酶基因產(chǎn)物主要是來源于微生物（真菌和大多數(shù)細(xì)菌）的3-植酸酶，而在宿主植物籽實(shí)中天然存在的多為6-植酸酶。植物籽實(shí)自身6-植酸酶的存在，將直接干擾和影響外源3-植酸酶的活性檢測。如何分離純化植物自身6-植酸酶，將成為轉(zhuǎn)植酸酶基因作物外源3-植酸酶產(chǎn)物活性檢測的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種6-植酸酶的特異性分離純化方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種6-植酸酶的特異性分離純化方法，所述方法先利用高能電子束以肌醇六硫酸鉀分子為交聯(lián)劑對介孔硅基材料加以改性；再利用改性后的介孔硅基材料特異性吸附樣品中的6-植酸酶，形成6-植酸酶與肌醇六硫酸鉀分子結(jié)合的表面快速反應(yīng)體系；經(jīng)植酸鈉溶液洗脫后，樣品中的6-植酸酶得以分離和純化。

進(jìn)一步地，所述高能電子束束流為0.5mA，電子束能量為5MeV，輻照劑量為10kGy。

其中，所述介孔硅基材料為SBA-15，二維六角相，孔徑7-8nm，平均粒徑60nm。

進(jìn)一步地，所述分離純化方法具體為：首先用高能電子束輻照活化介孔硅基材料SBA-1515min，然后加入交聯(lián)劑肌醇六硫酸鉀分子后繼續(xù)輻照30min，完成全部改性交聯(lián)過程；輻照時(shí)，為避免電子束能量過大，工作環(huán)境溫度控制在4℃；隨后將含有植酸酶的樣品與改性的介孔硅基材料在25℃條件下溫育1h，以10.0mM植酸鈉溶液（+2mM氯化鈣+2mM氯化鎂）洗脫分離，即得到純化的6-植酸酶。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明通過高能電子束輻照以肌醇六硫酸鉀分子為交聯(lián)劑對介孔硅基材料加以改性，達(dá)到特異性吸附6-植酸酶的功效。同時(shí)，此特異性吸附能夠競爭性地洗脫解離，從而獲得純度較高的6-植酸酶活性。本發(fā)明通過特異性分離純化去除宿主植物籽實(shí)中天然存在的6-植酸酶，亦使得外源3-植酸酶的活性測定更為精確。適用于特定環(huán)境樣品如土壤、水體和轉(zhuǎn)基因作物籽實(shí)根中6-植酸酶樣品測定。

附圖說明

圖1為高能電子束發(fā)生器示意圖；

圖2為用于改性的介孔硅基材料SBA-15的掃描電鏡圖；

圖3為交聯(lián)劑肌醇六硫酸鉀的分子結(jié)構(gòu)式；

圖4為介孔硅基材料SBA-15的改性示意圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

采用JSM-35CF型電鏡自行搭建的高能電子發(fā)生器（圖1），功率10kW，產(chǎn)生電子束流0.5mA，電子束能量為5MeV，輻照劑量為10kGy。改性的介孔硅基材料為SBA-15，二維六角相，孔徑為7-8nm，平均粒徑60nm（圖2）。改性交聯(lián)劑肌醇六硫酸鉀分子為植酸酶底物植酸分子的結(jié)構(gòu)類似物，對6-植酸酶有高親合力（圖3）。

輻照時(shí)首先用高能電子束輻照活化介孔硅基材料（SBA-15，5g）15min，待加入交聯(lián)劑肌醇六硫酸鉀分子（1g）后繼續(xù)輻照30min，完成全部改性交聯(lián)過程。輻照時(shí)為避免電子束能量過大，工作環(huán)境溫度控制在4℃。具體流程框架如圖4。改性后的介孔硅基材料通過肌醇六硫酸鉀分子形成6-植酸酶結(jié)合的表面快速反應(yīng)體系，能特異性吸附6-植酸酶。

實(shí)施例2