[發明專利]溫和氣單胞菌的LAMP檢測引物組及試劑盒

有效

• 申請號: 201410081114.3
• 申請日: 2014-03-06
• 公開（公告）號: CN103923977A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發明（設計）人: 柯浩;李嘉彬;馬艷平;劉振興;郝樂;馬江耀;梁志凌
• 申請（專利權）人: 廣東省農業科學院動物衛生研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司 44104
• 代理人: 宣國華

技術領域

本發明屬于溫和氣單胞菌檢測技術領域，具體涉及一種溫和氣單胞菌的LAMP檢測引物組及試劑盒。

背景技術

溫和氣單胞菌（Aeromonas?sobria，AS）隸屬于弧菌科，氣單胞菌屬，為革蘭氏陰性桿菌。廣泛分布于淡水、污水、土壤以及人的食物鏈，是水產養殖中危害較大的致病菌之一，此病常暴發流行，死亡率高，能引起出血性敗血癥，主要危害中華鱉、巴西龜、羅非魚、鯉魚、黃鱔、鰻鱺、泥鰍、蟹。同時也可以通過被污染的水產品、畜禽肉類和水源等途徑感染人，引發患者出現急性腹瀉，也可能引起腦膜炎、膿毒性關節炎和敗血癥。不僅給養殖業造成嚴重的經濟損失，同時給人類健康帶來危害，是一種重要的人-畜-魚共患病的病原體。國內外學者普遍認為，早發現疾病并采取諸多措施阻止細菌傳播，是綜合預防有效的方法。因此，建立靈敏、準確、快捷、方便的溫和氣單胞菌檢測方法是減少溫和氣單胞菌發生和危害的重要途徑。

目前溫和氣單胞菌的檢測方法主要有生化檢驗法和分子生物學方法等。由于氣單胞菌的生化性狀上極為相似，在常規診斷上需通過生化檢驗排除其它種，檢驗方法步驟繁瑣、需要鑒定的生化反應數目多，耗時長，且易造成結果不準確，特別是鑒定到種的水平，尤為困難，其特異性和靈敏度低，遠不能滿足日常快速檢測工作的需要。PCR技術自問世以來，憑借靈敏、特異、快速等優點，被普遍應用于水產養殖病原的檢測中。但PCR技術對實驗人員和環境的要求高，儀器設備復雜、操作步驟多。與一般PCR技術相比，熒光PCR檢測技術簡化了操作步驟，而且可消除擴增產物引起的交叉污染，減少假陽性的發生。但實時熒光PCR的儀器設備昂貴，使用成本較高，無法滿足現場檢測需要。目前檢測方法正向更特異、更快速、更便捷、定量化、費用低廉化的方向發展。因此，建立檢測溫和氣單胞菌快速準確的方法，對促進中國水產養殖、水產品安全及口岸檢疫有重要作用。

環介導等溫擴增（loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP）是NOTOMI等建立的一種新的核酸擴增技術，其特點是針對靶基因的6（或8）個區域設計4（或6）種特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶（Bst?DNA?polymerase），在60～65℃的恒溫條件下，歷時幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應，不需要模板的熱變性、長時間溫度循環、電泳等過程，基因的擴增及產物檢測可一步完成。LAMP反應中可形成明顯的白色焦磷酸鎂沉淀，可通過對濁度的觀察或加入熒光染料，直接通過顏色變化來判定反應結果。該技術具有高特異性、高效性、快速、簡便、易檢測等特點，適合基層推廣檢測，符合疾病檢測的快速、準確的診斷需要，已廣泛應用于細菌、病毒、寄生蟲等病原體的檢測研究，并取得了較理想的效果。但是迄今為止，市場上還未見用于檢測溫和氣單胞菌的LAMP檢測引物及試劑盒問世。

發明內容

本發明的目的在于提供一種溫和氣單胞菌的LAMP檢測引物組，該引物組特異性強，靈敏度高。

本發明的目的還在于提供一種溫和氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒，該試劑盒靈敏度高，快速，簡便，成本低。

本發明的第一個目的是通過如下技術方案來實現的：一種溫和氣單胞菌的LAMP檢測引物組，包括一對外引物AS-F3和AS-B3，一對內引物AS-FIP和AS-BIP，以及一對環引物AS-LF和AS-LB，其中AS-F3的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1中所示，AS-B3的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2中所示，AS-FIP的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3中所示，AS-BIP的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4中所示，AS-LF的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5中所示，AS-LB的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.6中所示。

各引物具體的核苷酸序列分別如下所示：

AS-F3：CGGACGAATGGACTCGAA（SEQ?ID?NO:1）。

AS-B3：AAGCTCTGGCAGAGGCTC（SEQ?ID?NO:2）。

AS-FIP：AACGCAGGAGTGGCACGATTTGACAGCGATGGCATC（SEQ?ID?NO:3）。

AS-BIP:GAAGACGAGGAAGAGGATCTGCAATTCGTCTTCCTGATAGACAG（SEQ?ID?NO:4）。

AS-LF：AGCGAGTTCCGGCTCTTC（SEQ?ID?NO:5）。

AS-LB：CACTTCGCAAGCCTGCTG（SEQ?ID?NO:6）。