[發明專利]一種利拉魯肽生物學活性的檢測方法

有效

• 申請號: 201410079787.5
• 申請日: 2014-03-06
• 公開（公告）號: CN103884846A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 盧旻衎;周亮;曹陽;戎亞雯;吉鵬飛;馬國昌
• 申請（專利權）人: 杭州九源基因工程有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/76
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 徐關壽

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種利拉魯肽生物學活性的測定方法。

發明背景

糖尿病在世界范圍內日益嚴重威脅人類健康。胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like?peptide-1），簡稱GLP-1，是腸道L細胞分泌的一種多肽類激素，具有促進胰島素分泌、促進胰島β細胞增殖和分化的功能。它通過刺激胰島素分泌、抑制胰高血糖素分泌、抑制胃排空發揮降血糖的作用。由于它對胰島素的刺激具有葡萄糖依賴性，因此不引發低血糖癥狀。

天然GLP-1因半衰期短（僅1～2分鐘）不適合臨床應用。利拉魯肽與GLP-1有97%的同源性，在臨床上用于成人2型糖尿病患者控制血糖。其分子結構與天然人GLP-1分子的不同之處是：第34位的賴氨酸被精氨酸取代，第26位的賴氨酸上增加了一個由谷氨酸介導的16碳脂肪酸側鏈。利拉魯肽半衰期長達13小時，每日只需皮下注射1次，即可有效控制血糖24小時。

生物制品的生物學活性是生物制品質量評價的重要指標，因此利拉魯肽的生物學活性測定方法是利拉魯肽質量研究的重點之一。目前利拉魯肽生物學活性欠缺簡便、快速、準確的測定方法。

利拉魯肽屬于GLP-1類似物，它與細胞膜上GLP-1受體（G蛋白偶聯受體）相互作用后，細胞內腺苷酸環化酶(adenylate?cyclase)被激活，導致胞內cAMP水平升高。胞內cAMP水平檢測法被廣泛用于定量測定GLP-1及其類似物的體外生物學活性，屬于細胞基礎的受體結合法。利拉魯肽原研廠為novo?nordisk公司。在該公司專利CN97198413.1中為檢測GLP-1衍生物的生物活性，測定了它們在表達人胰腺GLP-1受體的細胞系內刺激cAMP形成的能力，使用了幼倉鼠腎細胞（BHK）和閃爍親近測定法（說明書第61/62頁）。由于表達人胰腺GLP-1受體的幼倉鼠腎細胞難以獲得；而且閃爍親近測定法使用了放射性同位素，對人體有危害，因此需要開發一種操作簡單、安全可靠的利拉魯肽生物活性測定方法。

發明內容

本發明提供了一種利用cAMP依賴型蛋白激酶A活性分析法測定利拉魯肽生物學活性的新方法，從而解決了利拉魯肽生物學活性測定的難題。

目前實驗中，大多數使用的是放射性同位素測定法和cAMP酶聯免疫反應分析法來測定胞內cAMP水平。但是放射性同位素對人體有危害，實驗操作不方便。而cAMP酶聯免疫反應分析法通過ELISA方法測定，該方法步驟繁瑣，整個實驗過程周期較長，而且實驗誤差相對較大，因而結果不是非常理想。

本申請發明通過大量實驗和對比研究后，第一次創造性地將cAMP依賴型蛋白激酶A活性分析法原理應用于利拉魯肽的生物學活性測定。cAMP依賴型蛋白激酶A活性分析法原理是：裂解細胞釋放出胞內cAMP，cAMP激活蛋白激酶A催化蛋白質磷酸化反應而消耗ATP。ATP的減少反映為化學發光信號的減弱。cAMP水平越高，蛋白激酶A的活性就越高，消耗ATP更多，從而化學發光信號越弱。

發明人發現相比于cAMP酶聯免疫反應分析法，cAMP依賴型蛋白激酶A活性分析法更為方便，實驗步驟少，試驗結果更為精確，誤差相對較小，因而是一種比較理想的測定胞內cAMP水平的方法。

因而，本發明建立了一種利拉魯肽生物學活性的檢測方法，所述方法包括如下步驟：

（1）分別制備利拉魯肽對照品溶液和供試品溶液，設置稀釋濃度梯度；

（2）培養大鼠胰島瘤細胞RIN-m5F后，加入步驟（1）中制備的對照品及供試品溶液刺激細胞；

（3）用cAMP依賴型蛋白激酶A活性分析法試劑盒檢測利拉魯肽刺激后細胞內cAMP水平變化，用酶標儀的化學發光檢測模塊讀取相對化學發光單位（RLU）。

（4）以稀釋倍數或藥物濃度為橫坐標，以相對化學發光單位為縱坐標，利用統計軟件擬合實驗數據，得到利拉魯肽的劑量效應曲線，計算出供試品和對照品的半效稀釋倍數，按照以下公式計算供試品的生物學活性：