[發明專利]一種重組家蠶素的表達方法及其抗腫瘤應用

有效

• 申請號: 201410079147.4
• 申請日: 2014-03-05
• 公開（公告）號: CN103937808B
• 公開（公告）日: 2017-01-18
• 發明（設計）人: 趙紅平;馮西橋;龍燕;鄒鳳竹;黃慧明
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12N15/17
• 分類號: C12N15/17;C07K14/62;C12N15/70;A61K38/28;A61P35/00;A61P35/02
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司11246
• 代理人: 陳波

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種重組家蠶素的表達方法及其抗腫瘤應用。

背景技術

家蠶素（bombyxin）是無脊椎動物中首個被鑒定的昆蟲胰島素，由4對位于蠶蛾腦中央背部的大型神經分泌細胞分泌。其中，天然成熟的家蠶素分子量約5kD，為異二聚體分子，含有兩條氨基酸鏈：A鏈與B鏈，其中A鏈由20個氨基酸組成，B鏈由26或28個氨基酸組成。家蠶素的A鏈與B鏈之間有兩個二硫鍵相連，A鏈自身由一個二硫鍵相連。家蠶素與人類胰島素具有高度同源性，其A鏈與B鏈對應人胰島素的A鏈與B鏈的相似度分別達50%和30%。

家蠶素基因屬于基因組多拷貝基因，目前在家蠶中已發現至少38種家蠶素基因，其中32種家蠶素基因都無內含子；根據家蠶素基因序列的相似程度分成A、B、C、D、E、F、G等7個亞族；家蠶素基因主要在蠶腦組織表達，在蠶的其它組織中表達量較低。

從昆蟲遺傳學角度相繼證明了家蠶素在昆蟲體內具有參與糖代謝調控、調節變態發育、調控前胸腺分泌活性、促進翅芽形成、促造血器官細胞增殖以及卵巢發育等生理功能。

日本學者曾經從3千萬頭蠶蛾頭部中提取出微克量級的家蠶素。從生物資源的開發角度來看，成本耗費太高，無法充分體現其資源的優越性。有報道通過化學合成獲得家蠶素，合成過程復雜，產量較低，而且易摻雜很多化學成分，最終得到的家蠶素往往無法保證其天然的生物活性。通過真核或者原核表達系統能實現家蠶素的表達，可克服上述制備技術的缺陷，并使家蠶素的制備更快捷、簡單，表達水平更高。

目前抗腫瘤多肽藥物是腫瘤治療領域最具開發性的新領域，以其低毒、高效、特異性廣譜等特點用于癌癥治療。研究開發出具有重要生物功能的多肽，可為抗腫瘤新藥的開發帶來重要的影響。

已有實驗證實，家蠶素可通過PI3K信號途徑促進腫瘤細胞的糖原合成，但其在體內外抗腫瘤活性及其在藥物方面的應用仍未見公開報道。

發明內容

本發明的目的在于克服現有的制備家蠶素的缺點，提供一種極為簡便、工序少、設備簡單、能耗小、投入資金少、高效而且適合實驗室研究制備和大規模工業生產的制備重組家蠶素的方法。

本發明的目的是這樣實現的：

一種重組家蠶素的表達方法，制備方法包括以下步驟：

（1）優化家蠶素基因：根據表達系統對刪除編碼信號肽序列基因的家蠶素基因bbxA6進行密碼子偏好優化，添加酶切位點和純化標簽，人工合成基因片段；

（2）構建重組克隆載體：將將步驟（1）中的人工合成基因片段與克隆載體連接，轉化到大腸桿菌中，挑選陽性克隆；

（3）構建重組表達載體：將表達載體和步驟（2）重組克隆載體酶切、純化、回收目的基因片段與線性化表達載體、連接目的基因片段與線性化表達載體，構建重組表達載體，將重組表達載體線性化后轉化到酵母菌中，經篩選得到酵母菌轉化子；

（4）表達重組家蠶素：將步驟（3）所篩選的轉化子培養、誘導、分離、純化得到重組的家蠶素。

步驟（1）中所述純化標簽可選擇6×His、GST、MBP、exact、Flag、His-MBP、His-Myc、His-AviTag^TM、His-Sumo、SNAP-Tag^TM或HaloTag^TM。

步驟（1）中所述家蠶素基因為bbxA6，優化后的家蠶素基因bbxA6的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。

步驟（3）中所述的表達載體為pPIC9、pPIC9k、pHIL-S1、pPICza、pYAM75P6、pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10、pGAPZ、pGAPZa、pYES2、pYES2/NT、pYES2/CT、pYES3，pYES6、pYCplac22-GFP、pAUR123、pRS303TEF、pRS304、pRS305、pRS306、pY13TEF、pY14TEF、pY15TEF、pY16TEF、pSH47、pHISi，pLacZi、pHIS2或pGAD42。

步驟（3）中所述的酵母菌為畢赤酵母菌GS115。

步驟（4）中所述的重組的家蠶素為家蠶素II。

還提供另一種重組家蠶素的表達方法，制備方法包括以下步驟：

（1）優化家蠶素基因：根據表達系統對家蠶素基因bbxE1進行密碼子偏好優化，添加酶切位點和純化標簽，人工合成基因片段；