[發(fā)明專(zhuān)利]人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410078044.6
• 申請(qǐng)日: 2014-03-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103849598A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-06-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許評(píng);張炳強(qiáng);宋崗;陳立材;史光軍;于麗
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 青島中天干細(xì)胞工程有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/0775
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/0775
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于：它包括以下具體步驟：

（1）、脂肪的采集：無(wú)人源特定病毒的供體篩選合格后，無(wú)菌采集脂肪，可采用抽脂方式或者手術(shù)方式獲取脂肪，采集量?10ml以上，采集后，將脂肪置于保存液中，2-8℃恒溫保存；

（2）、脂肪的運(yùn)輸：將脂肪置于保存液中，2-8℃恒溫保存在疫苗箱中，48h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室；

（3）、脂肪的交接：實(shí)驗(yàn)室接收脂肪，登記好客戶(hù)信息，并進(jìn)行客戶(hù)編碼；

（4）、制備脂肪微塊：用含青霉素和鏈霉素的PBS反復(fù)沖洗，去除殘留的血液，將脂肪絞碎為0.5-1mm³的脂肪微塊；

（5）、脂肪微塊的凍存：二甲基亞砜和血清替代品按照1:9的比例混合配成凍存液，將脂肪微塊用凍存液重懸，分裝到凍存管中，放入凍存盒，置于-80℃冰箱過(guò)夜后，次日轉(zhuǎn)移到液氮保存；

（6）、脂肪微塊的復(fù)蘇：從液氮中取出要復(fù)蘇的脂肪組織微塊，立即投入37℃無(wú)菌水浴鍋中，勻速輕輕搖晃，使其在2分鐘之內(nèi)融化；

（7）SVF提取：0.1%膠原酶I消化脂肪微塊，離心棄去上層，100um濾網(wǎng)過(guò)濾，獲得SVF；

（8）、原代培養(yǎng)：按照1×10⁵個(gè)／ml接種到培養(yǎng)瓶，將培養(yǎng)瓶放置于二氧化碳恒溫恒濕培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件：?37±0.5℃，二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5±0.2%?，培養(yǎng)：人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基；

（9）、傳代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)經(jīng)7d左右，細(xì)胞融合達(dá)70%～80%時(shí)，按照5000～6000個(gè)/cm²的密度傳P1，經(jīng)3d，P1代融合達(dá)80%～90%時(shí)，同上，傳P2，以此類(lèi)推。