[發明專利]一種RNA保存液、包含該保存液的試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201410077772.5
• 申請日: 2014-03-05
• 公開（公告）號: CN103881978A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 徐凱;唐放;李四軍;張耀藝
• 申請（專利權）人: 成都諾恩生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10
• 代理公司: 北京國林貿知識產權代理有限公司 11001
• 代理人: 胡琳梅

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，特別涉及一種RNA保存液、包含該保存液的試劑盒及其應用。?

背景技術

核糖核酸（RNA,Nuecleic?Acid）為細胞的主要成分之一，參與細胞的各種功能活動，是生物學，醫學，藥學等生命有關學科研究的重要對象。?

在絕大多數涉及RNA表達的研究或醫療應用的診斷預后測定中，均需用高度純化的RNA作反應的底物。但是，純化后的RNA極易被核糖核酸酶（即RNase）降解和受冷凍融化過程的影響而斷裂。在生物樣品中廣泛存在并極度穩定的RNase對RNA的水解作用很強，許多RNase對RNA的降解作用不需任何輔助因子，給RNA的純化、儲存和使用帶來極大困難。?

實際應用中，用不含RNase的水或加入了EDTA、檸檬酸鈉等螯合劑的水溶解的RNA可在-80℃的超低溫冰箱中保存一年，凍存過程中樣品在水溶劑從液態轉變為固態，使用時尚需融化成液態，部分RNA在此過程中因相變形成的物理張力的剪切作用而斷裂，反復凍融引起不可忽視的損害，如果是微量的RNA樣品這種保存方法幾乎無法勝任。?

為了解決反復凍融對RNA造成損害的問題，現有技術采用將RNA溶解于甲酰胺的方法。甲酰胺作溶劑可保證純化后的RNA在-20℃條件下保存一年以上并可反復凍融使用而無降解。溶解于甲酰胺的RNA發生構象變化，RNA分子受到壓縮，體積比在水溶劑里小。但是，甲酰胺雖然可以抑制RNase反應，同時也會致使RNA變性，增大溶解難度，直接將甲酰胺溶解的RNA用于酶反應會對反應效率帶來不確定的影響，使用前需重新沉淀以去除甲酰胺，極大的限制了其應用。?

另外，RNA經乙醇沉淀后存放于-20℃可以做到長期保存，但每次使用均需將RNA重新離心洗滌、溶解，給RNA驗證引入額外的誤差，影響測量的重復性，無助于RNA的反復使用。?

當然，許多其他的化學變性劑被報道或者已經用于保存含有RNA的生物樣品，如商業化了的RNAlater、TRIZol等，這些試劑含有酶反應抑制因子和蛋白質變性劑以保證RNA在純化之前不被降解。這些抑制因子在隨后的分離純化過程中被除掉，不會存留于純化后的RNA樣本中。有時候這些試劑也籠統地被稱為RNA保存液，其用途是保護生物樣本中的RNA在純化以前不受降解，而非純化后RNA的保存。?

綜上所述，降解或部分降解的RNA會導致基因表達譜的改變，提取并保證高質量的RNA對準確測定目標基因有重大意義。一種能夠有效阻止RNase降解、可避免RNA反復凍融造成的物理損傷并且不影響后續反應效率RNA保存液，對RNA的分子生物學研究和臨床上的應用非常重要，也是目前RNA保存迫切需要解決的重要技術難題。?

發明內容

本發明的發明目的之一，在于針對上述存在的問題，提供一種可避免RNA反復凍融造成的物理損傷并且不影響后續反應效率的RNA保存液。?

本發明采用的技術方案是這樣的：一種RNA保存液，該保存液是濃度為3.8M-5.2M的甜菜堿水溶液。?

甜菜堿（Betaine,也稱Trimethylglycine或Oxyneurine），是一種天然次生代謝產物，參與膽堿的氧化代謝和細胞滲透的平衡等多種生化生理功能活動。關于甜菜堿，已經有很多應用。本申請的發明人通過大量實驗，得到上述的技術方案。甜菜堿屬于惰性很高的化學物質，溶于高純度的水可形成pH7.8左右的微堿溶液，甜菜堿溶液高度穩定，可在室溫或4℃的條件下長期保存而無分解。將3.8M-5.2M的甜菜堿溶液保存于4℃的條件下3年之久后，仍可用于增強PCR擴增，不會引起DNA的降解。含有2.4?M的甜菜堿的PCR濃縮液，在-20℃條件下可穩定保存4年仍能用于擴增單位數的DNA分子。在實際應用中，3.8M-5.2M的甜菜堿溶液可保存在4℃潮濕的環境中，即使保存環境已出現細菌生長，也不影響其重復使用。由于甜菜堿的高滲透性，高濃度的甜菜堿溶液具有明顯的抑制細菌生長的作用。而Tris或檸檬酸用作RNA溶解保存液，均需小心避免細菌污染，否則，細菌可在這些溶液里生長并提供大量的RNase，不利于微量RNA的保存和反復使用。?

在本申請中，我們把濃度大于3.8?M的甜菜堿溶液稱為高濃度甜菜堿溶液。本領域公知的，本發明中的溶液濃度單位“M”為“mol/L”。?

實驗證明：用3.8M-5.2M的甜菜堿溶液保存的RNA可在-20℃條件下可完整保存至少一年，或在4℃儲存可完整保存一周，因此可用冰袋保存，便于郵寄和運輸。?