[發(fā)明專利]CRISPR-Cas9特異性敲除人PD1基因的方法以及用于特異性靶向PD1基因的sgRNA

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410077474.6
• 申請日: 2014-03-04
• 公開（公告）號: CN103820454A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發(fā)明（設計）人: 胡邊;黃行許
• 申請（專利權）人: 黃行許
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85
• 代理公司: 江蘇銀創(chuàng)律師事務所 32242
• 代理人: 何震花

技術領域

本發(fā)明屬于基因工程領域，更具體地說涉及CRISPR-Cas9特異性敲除人PD1基因的方法以及用于特異性靶向PD1基因的sgRNA。?

背景技術

規(guī)律成簇間隔短回文重復系統(tǒng)（clustered?regularly?interspaced?short?palindromic?repeat;CRISPR-associated，CRISPR-Cas9）是一種具有核酸內(nèi)切酶活性的復合體，識別特定的DNA序列，進行特定位點切割造成雙鏈DNA斷裂（Double-strand?breaks,DSB），在沒有模板的條件下，發(fā)生非同源重組末端連接（Non-homologous?end?joining,NHEJ）,造成移碼突變（frameshift?mutation），導致基因敲除（圖1）。?

這一技術由于能快速、簡便、高效地靶向基因組任何基因，從而引起了廣泛的關注，在2012年開始像爆炸一般流行開來。由于其容易操作、可以同時靶向多個基因，可以高通量制備、造價低等優(yōu)勢，Cas9已經(jīng)成為一種發(fā)展最快的技術（Pennisi,2013）。正是由于其優(yōu)越性，這一技術在Nature推薦的2013十大進展中位列第一（http://www.nature.com/news/365-days-nature-s-10-1.14367），在Science推薦的2013十大進展中位列第二位（http://news.sciencemag.org/breakthrough-of-the-year-2013）。?

Cas9靶向切割DNA是通過兩種小RNA——crRNA（CRISPR?RNA）和tracrRNA(trans-activating?crRNA)和靶序列互補識別的原理實現(xiàn)的。現(xiàn)在已經(jīng)把兩種小RNA融合成一條RNA鏈，簡稱sgRNA（single?guide?RNA）。因此，sgRNA能否做到特異性、精確靶向目標基因是CRISPR-Cas9能否特異性敲除目標基因的先決條件，無論是脫靶還是錯誤靶向，都會影響CRISPR-Cas9對目標基因的特異性敲除。因此，能夠設計、制備出精確性和特異性靶向目標基因的sgRNA成為CRISPR-Cas9基因敲除的關鍵技術（圖1）。?

腫瘤免疫治療，尤其是對免疫檢查點的阻斷，是當前靶向基因治療最成功的領域。免疫檢查點是指維持免疫自我耐受，以及調(diào)節(jié)生理條件下的免疫反應強度和持續(xù)時間的一系列免疫抑制性反應。研究表明，腫瘤細胞和免疫檢查點途徑協(xié)同作用，產(chǎn)生了抑制腫瘤免疫的效果，特別是抑制腫瘤抗原特異的效應T細胞的作用。對免疫檢查點的阻斷，是指利用T細胞免疫檢查抑制性受體的單克隆抗體，特異性阻斷抑制性受體與其配體的結合，從而阻斷免疫檢查機制抑制T細胞活化的作用，增強效應T細胞的抗腫瘤效果。?

已經(jīng)成功用于臨床的腫瘤免疫治療的免疫檢查靶點之一是免疫抑制性受體，PD1基因。PD1的主要功能是限制外周組織的效應T細胞活性。腫瘤細胞表達的PD1配體和T細胞的PD1結合，抑制T細胞激活相關激酶，從而抑制效應T細胞活性。利用PD1單克隆抗體（MDX-1106、MK3475、CT-011、AMP-224等），?抑制PD1配體和PD1結合，從而達到治療腫瘤的效果。?

但是，利用PD1抗體的治療只在黑色素癌療效較好，對腎癌和肺癌有部分療效。因為利用抗體進行靶基因的治療還受到一些因素的限制：（1）抗體的作用只是暫時阻斷的作用；（2）抑制性受體有多種，如何利用多種抗體同時阻斷多種抑制性受體還沒有對策；（3）不容易研發(fā)出有效的抗體；（4）只針對細胞外靶點；（5）抗體藥物昂貴，等。?

CRISPR-Cas9快速、簡便、高效、特異性靶向敲除基因，通過靶向敲除PD1基因，為實現(xiàn)腫瘤免疫治療提供了一種可行的策略。但是，能否設計、制備出精確性和特異性靶向PD1基因的sgRNA成為CRISPR-Cas9特異性敲除PD1基因的關鍵技術。本發(fā)明的目的就是要解決這一關鍵技術問題，提供相應的技術方案，達到特異性敲除PD1基因的目的。?

參考文獻：?

Mali?P,Esvelt?KM,Church?GM.Cas9as?a?versatile?tool?for?engineering?biology.Nat.Methods.2013;10(10):957-963.?