[發明專利]一種單克隆表面展示核酸適體快速篩選方法

有效

• 申請號: 201410076295.0
• 申請日: 2014-03-04
• 公開（公告）號: CN103911432A
• 公開（公告）日: 2014-07-09
• 發明（設計）人: 楊朝勇;朱志;宋彥齡;李聰;鄒遠;朱玲;安源
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/115
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭

技術領域

本發明涉及一種針對多種靶標的單克隆表面展示核酸適體快速篩選方法，屬于核酸適體篩選技術開發領域。

背景技術

核酸適體作為一類新型的分析、診斷分子，自出現以來，受到科研工作者的廣泛關注。因其優于傳統蛋白單克隆抗體的諸多特性，核酸適體已成為新興的研究領域，在科研、疾病診斷和治療試劑等方面逐步取代傳統的抗體類診斷和生物技術產品。（1.G.Mayer,The?chemical?biology?of?aptamers,Angew?Chem?Int?Ed?Engl[J].2009,48,2672-2689;2.M.Mascini,I.Palchetti,S.Tombelli,Nucleic?acid?and?peptide?aptamers:fundamentals?and?bioanalytical?aspects,Angew?Chem?Int?Ed?Engl[J].2012,51,1316-1332.）核酸適體是指從人工合成的單鏈DNA/RNA文庫中篩選得到的能夠高特異性地和高親和力地與靶標分子結合的單鏈寡核苷酸。核酸適體借助氫鍵、范德華力、疏水作用等分子間弱作用力形成特殊的三維結構，如發夾、假結、凸環、G-四聚體等，從而特異地識別靶物質甚至影響其生物活性。核酸適體本身特有的生化特性使其在生物醫學應用領域具有諸多優勢，如靶分子范圍廣、親和力與特異性強、合成修飾方便快速、分子量較小、良好的生物兼容性、無毒、體外穩定性好等。

目前人們研究和報道的絕大多數核酸適體都是通過SELEX技術獲得的。SELEX技術即配體指數富集系統進化技術（Systematic?Evolution?of?Ligands?by?Exponential?Enrichment），主要是基于達爾文的進化論思想：變異、選擇、復制，在試管里模擬自然環境中的進化過程，在很短的時間內篩選出符合特定要求的核酸適配體。該方法最早由Larry?Gold、Jack?Szostak及Gerald?Joyce于1990年提出。（3.C.Tuerk,L.Gold,Systematic?evolution?of?ligands?by?exponential?enrichment:RNA?ligands?to?bacteriophage?T4DNA?polymerase,Science[J].1990,249,505-510;4.A.D.Ellington,J.W.Szostak,Invitro?Selection?of?RNA?Molecules?That?Bind?Specific?Ligands,Nature[J].1990,346,818-822.）伴隨著功能核酸在生物學、醫藥學、環境和疾病檢測等方面逐步擴大的影響和應用前景，如何準確、高效、經濟地獲得更多的功能核酸也成為人們關注的焦點。在至今的二十多年里，SELEX技術不斷被研究者革新、創新，篩選方式更是變得靈活多樣，篩選的靶分子也從金屬離子、有機小分子、蛋白質等拓展到了細胞、組織等復雜靶標，顯示了該技術強大的應用空間。

SELEX最基本的篩選途徑是：首先，將大容量的隨機寡核苷酸序列庫（1013～1015個隨機寡核苷酸序列）與靶分子共同孵育，通過各種分離途徑將靶標分子-寡核苷酸復合物與未結合的寡核苷酸序列分離。再通過熱變性等洗脫方式獲得與靶分子結合的寡核苷酸序列，并對這些序列進行聚合酶鏈式反應（PCR），擴增生成次級文庫，用于下輪篩選。如此數輪反復篩選后得到富集文庫，對該富集文庫進行細菌單克隆并測序，最終獲得能夠特異性識別靶分子的寡核苷酸序列，即核酸適配體。用于篩選的隨機寡核苷酸庫的兩端通常為固定序列，與PCR擴增的引物序列匹配；中間為15～60個堿基的隨機序列，幾乎涵蓋了所有可能的立體構象，理論上可以針對任何靶分子篩選出特異性的核酸適配體。

SELEX技術是一個相對復雜的過程，其篩選成功率受到眾多因素影響，如文庫的設計、分離技術的針對性和普適性、靶分子的結構性質、緩沖液的類型以及所含離子種類等。目前尚未有報道針對任意靶標的標準SELEX篩選方法。通常蛋白質或小分子靶標須進行8-12輪篩選，細胞、組織等甚至需要20輪，耗費大量人力和時間，也同時限制了核酸適體的發展。