[發(fā)明專利]一種治療原發(fā)性肝癌的干細(xì)胞制劑及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410075512.4
• 申請(qǐng)日: 2014-03-04
• 公開（公告）號(hào): CN103861088A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周萱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 奧思達(dá)干細(xì)胞有限公司
• 主分類號(hào): A61K38/18
• 分類號(hào): A61K38/18;A61K35/44;A61P35/00;A61P1/16
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種治療原發(fā)性肝癌的細(xì)胞制劑及其制備方法。這種細(xì)胞制劑中的細(xì)胞來自臍帶中的間充質(zhì)干細(xì)胞，添加肝細(xì)胞生長因子和成纖維細(xì)胞生長因-4，細(xì)胞懸浮在1毫升自體富血小板血漿裂解液中，用于治療原發(fā)性肝癌造成的肝細(xì)胞損傷。

背景技術(shù)

原發(fā)性肝癌(hepatocellular?carcinoma，HCC)居惡性腫瘤發(fā)病率的第五位,?全球每年死亡人數(shù)約100萬。目前，大部分原發(fā)性肝癌患者缺乏有效的治療手段,總的生存率僅為3%~5%。原發(fā)性肝癌的發(fā)生是多因素、多途徑、多步驟長期作用的結(jié)果，包括外環(huán)境致癌因素和自身遺傳因素。具有起病隱匿、潛伏期長、高度惡性、進(jìn)展快、侵襲性強(qiáng)、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差等特點(diǎn)。肝移植雖已成為治療原發(fā)性肝癌的重要手段，但供體短缺、手術(shù)損傷、免疫排斥以及費(fèi)用高昂等問題構(gòu)成了肝臟器官移植技術(shù)發(fā)展的主要障礙。因此，開展具有療效高、侵入性小、并發(fā)癥少等特點(diǎn)的干細(xì)胞移植具有重要的臨床意義。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal?stem?cells，MSCs）是來自于中胚層，并且可以向三個(gè)胚層分化的一類干細(xì)胞，在組織工程等方面有廣泛的用途，是國內(nèi)外廣泛關(guān)注的一類細(xì)胞。目前間充質(zhì)干細(xì)胞主要來自骨髓和脂肪，但骨髓和脂肪中的間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量有限，因其易被病毒感染以及較強(qiáng)的免疫原性等因素限制了其在臨床的應(yīng)用。

本發(fā)明采用的間充質(zhì)干細(xì)胞來源于臍帶中留存下來的未分化的原始細(xì)胞，具有長期自我更新和多向分化的潛能。臍帶的結(jié)構(gòu)從外到內(nèi)依次為臍帶上皮、羊膜下基質(zhì)、裂隙、血管間基質(zhì)（華通膠）、血管周圍基質(zhì)、血管（兩動(dòng)脈一靜脈）。目前從臍帶的不同的組織部位都獲得了間充質(zhì)干細(xì)胞，而其主要來源是血管間的華通膠基質(zhì)。

國內(nèi)外均已證明在特定條件下，間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)、體外特定誘導(dǎo)條件下均可轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞，并能行使肝細(xì)胞的功能。與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以其易得、原始、增殖力強(qiáng)、免疫原性低、不涉及法律倫理等優(yōu)勢(shì)而越來越受到人們的重視。有研究證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞在肝細(xì)胞生長因子和成纖維細(xì)胞生長因-4的作用下可形成肝細(xì)胞樣細(xì)胞，參與肝臟損傷的修復(fù)。間充質(zhì)干細(xì)胞可產(chǎn)生多種分子，如趨化因子、細(xì)胞因子和生長因子等，它們以旁分泌的形式調(diào)節(jié)和增強(qiáng)人體的免疫系統(tǒng)功能，從而增強(qiáng)機(jī)體的抗癌作用。

臍帶組織包含豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有以下特點(diǎn)：（1）增殖能力強(qiáng)：體外培養(yǎng)第七代后可擴(kuò)增300倍，且無明顯衰老跡象，具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化潛能，能分化成肝細(xì)胞樣細(xì)胞，多次傳代擴(kuò)增后仍具有干細(xì)胞特性。（2）免疫原性低：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可劑量依賴性的抑制激活T淋巴細(xì)胞增殖，同時(shí)可維持和促進(jìn)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞擴(kuò)增。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞抑制免疫細(xì)胞的增殖，不會(huì)引起同種異源或異種免疫細(xì)胞的增殖，具有免疫調(diào)節(jié)作用和較低的免疫原性。（3）致腫瘤風(fēng)險(xiǎn)低：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有穩(wěn)定的端粒酶活性，培養(yǎng)多代也不會(huì)喪失錨定依賴性和血清依賴性，在維持其增殖性的同時(shí)不具有致腫瘤性。（4）來源方便，易于分離培養(yǎng)、擴(kuò)增和純化。

富血小板血漿（PRP）裂解液是自體全血經(jīng)離心分離得到的，是血小板含量高于普通全血4～8倍的濃縮血漿。PRP中富含大量自體源性生長因子，這些生長因子相互協(xié)同作用，有促進(jìn)組織再生、創(chuàng)面愈合、新生血管形成、減少瘢痕等作用，能誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖分化。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種治療原發(fā)性肝癌的干細(xì)胞制劑及其制備方法。本發(fā)明所要解決的技術(shù)是彌補(bǔ)缺血心肌病目前常規(guī)治療方法的不足。

為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種治療原發(fā)性肝癌的干細(xì)胞制劑，它是由人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞按體重配制，并添加肝細(xì)胞生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子-4，細(xì)胞懸浮在富血小板血漿裂解液中制備而成。

進(jìn)一步的，所述的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞按（0.5~5）×10⁶個(gè)細(xì)胞每千克體重配制。

進(jìn)一步的，所述的肝細(xì)胞生長因子添加量為?20?ng／m1?，成纖維細(xì)胞生長因子-4添加量為10?ng／m1。

進(jìn)一步的，所述的富血小板血漿裂解液來自患者外周血。

進(jìn)一步的，所述的富血小板血漿裂解液每次用量為1ml。

一種治療原發(fā)性肝癌的干細(xì)胞制劑的制備方法，由下述步驟組成：

（1）采集臍帶，原代培養(yǎng)，獲得細(xì)胞；

（2）流式細(xì)胞儀檢測(cè)，此種細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記和黏附分子CD29、CD73、CD90、CD105，不表達(dá)CD14和CD34；

（3）制備自體富血小板血漿裂解液；