[發(fā)明專利]一種新型貝類促進(jìn)血淋巴細(xì)胞吞噬作用的調(diào)理素DCP

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410074589.X
• 申請日: 2014-03-03
• 公開（公告）號: CN103819550A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張揚;徐鳳姣;張躍環(huán);李軍;喻子牛
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院南海海洋研究所
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/12;C12N15/70;C12N1/21;A61K38/17;A61P37/04
• 代理公司: 廣州科粵專利商標(biāo)代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于應(yīng)用海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型貝類促進(jìn)血淋巴細(xì)胞吞噬作用的調(diào)理素DCP。

背景技術(shù)：

貝類是我國最重要經(jīng)濟(jì)類群之一，在沿海經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展中舉足輕重。太平洋牡蠣（Crassostrea?gigas）屬于軟體動物門、雙殼綱、珍珠貝目、牡蠣科動物，為全球性分布的經(jīng)濟(jì)貝類。然而，隨著近年來大規(guī)模的養(yǎng)殖，其免疫能力低下，導(dǎo)致的疾病爆發(fā)，已經(jīng)嚴(yán)重的制約了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

血淋巴細(xì)胞是貝類的核心免疫器官，其吞噬能力的強弱直接決定了其抗病能力的高低。在牡蠣體內(nèi)，有一類蛋白可以促進(jìn)血淋巴細(xì)胞的吞噬作用，被稱為調(diào)理素（opsonin）。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的是提供一種新型貝類促進(jìn)血淋巴細(xì)胞吞噬作用的調(diào)理素DCP。

本發(fā)明的新型貝類促進(jìn)血淋巴細(xì)胞吞噬作用的調(diào)理素DCP，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

本發(fā)明還提供了一種編碼上述新型貝類促進(jìn)血淋巴細(xì)胞吞噬作用的調(diào)理素DCP的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

一種含有新型貝類促進(jìn)血淋巴細(xì)胞吞噬作用的調(diào)理素DCP的基因的原核表達(dá)載體。

所述的原核表達(dá)載體可以為表達(dá)載體pET-28a。

一種含有含有新型貝類促進(jìn)血淋巴細(xì)胞吞噬作用的調(diào)理素DCP的基因的原核表達(dá)載體的細(xì)菌。

所述的細(xì)菌可以為大腸桿菌BL21(DE3)。

本發(fā)明還提供了新型貝類促進(jìn)血淋巴細(xì)胞吞噬作用的調(diào)理素DCP在制備促進(jìn)血淋巴細(xì)胞對弧菌吞噬作用藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明首次從太平洋牡蠣中分離一種包含DM9結(jié)構(gòu)域的蛋白（DM9domain-containing?protein，DCP），通過功能分析和鑒定，發(fā)現(xiàn)牡蠣的DCP可以同弧菌表面分子結(jié)合，極大的促進(jìn)血淋巴細(xì)胞的對弧菌吞噬作用，是一種新型的貝類調(diào)理素。本發(fā)明中的DCP具有強烈促進(jìn)血淋巴細(xì)胞的吞噬作用，為貝類的抗病防治提供了重要的理論與實踐依據(jù)。

附圖說明：

圖1.表達(dá)和純化貝類調(diào)理素DCP重組蛋白；

（M）蛋白Marker；（1）誘導(dǎo)前和（2）誘導(dǎo)后貝類調(diào)理素DCP-His重組蛋白；（3-7）純化后的貝類調(diào)理素DCP-His重組蛋白，不同的洗脫條件。

圖2.免疫熒光顯示貝類調(diào)理素DCP-His重組蛋白可以結(jié)合至副溶血弧菌Vibrio?parahaemolyticus表面；（A）光鏡下和（B）熒光顯微鏡下貝類調(diào)理素DCP-His同弧菌的結(jié)合；

（C）光鏡下和（D）熒光顯微鏡下BSA（陰性對照）同弧菌的結(jié)合。

圖3.流式細(xì)胞術(shù)分析貝類調(diào)理素DCP-His重組蛋白對V.parahaemolyticus的調(diào)理作用。

（A）不同蛋白孵育后，血淋巴細(xì)胞的熒光累計圖，紅色為對照BSA，綠色為貝類調(diào)理素DCP-His；（B）柱狀圖統(tǒng)計熒光強度，**表示極顯著差異，熒光值越高，代表吞噬能力越強，即貝類調(diào)理素DCP-His的調(diào)理作用越大。

具體實施方式

以下實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。

實施例1：

1、RNA提取

總RNA的提取使用Trizol(Invitorgen)提取，具體步驟如下：（1）取50mg太平洋牡蠣于液氮預(yù)冷的研缽中，將組織磨成粉末之后，轉(zhuǎn)移到裝有1ml?Trizol的離心管中，吹打、混勻；（2）加入200μL氯仿，劇烈震蕩40s，室溫放置5min；（3）4℃，12,000×g離心10min，吸取上清轉(zhuǎn)移至新管；（4）加入0.5ml的異丙醇，混勻，-80℃沉淀過夜；（5）4℃，12,000×g離心10min，棄上清；（6）75%乙醇wash兩次沉淀；（7）棄上清，加入100μL?DEPC水溶解RNA。

2.RACE（Rapid?Amplification?of?cDNA?Ends）和cDNA全長的獲得

（1）利用提取的RNA和GeneRacerTM?kit(Invitrogen)，構(gòu)建太平洋牡蠣RACE?cDNA文庫；（2）從牡蠣轉(zhuǎn)錄組獲得DCP的EST序列；（3）根據(jù)EST序列，設(shè)計用于RACE擴(kuò)增的引物（DCP-5’race1:5'-GAACCCGTCCTATGTAGATGCCGCTG-3'

DCP-5'race2:5'-GTCATTTCGCCCGAGACTACAGCCC-3'