[發明專利]豇豆葉綠體微衛星分子標記的多態性引物及其篩選方法、鑒定親緣關系的方法

有效

• 申請號: 201410074030.7
• 申請日: 2014-03-03
• 公開（公告）號: CN103911372B
• 公開（公告）日: 2017-01-25
• 發明（設計）人: 潘磊;陳禪友;李依
• 申請（專利權）人: 江漢大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 北京三高永信知識產權代理有限責任公司11138
• 代理人: 徐立

1.一種豇豆葉綠體微衛星分子標記的多態性引物，其特征在于，包括：

cpSSR3正向引物如序列表中SEQ?ID?NO.1所示；

cpSSR3反向引物如序列表中SEQ?ID?NO.2所示；

cpSSR9正向引物如序列表中SEQ?ID?NO.3所示；

cpSSR9反向引物如序列表中SEQ?ID?NO.4所示；

cpSSR10正向引物如序列表中SEQ?ID?NO.5所示；

cpSSR10反向引物如序列表中SEQ?ID?NO.6所示；

cpSSR12正向引物如序列表中SEQ?ID?NO.7所示；

cpSSR12反向引物如序列表中SEQ?ID?NO.8所示；

cpSSR14正向引物如序列表中SEQ?ID?NO.9所示；

cpSSR14反向引物如序列表中SEQ?ID?NO.10所示。

2.一種如權利要求1所述的多態性引物的篩選方法，其特征在于，所述方法包括：

提取不同品種豇豆的基因組DNA；

將設計的如序列表中SEQ?ID?NO.1-SEQ?ID?NO.30所示的引物和所述基因組DNA混合并進行PCR擴增，得到擴增產物；

將所述擴增產物與上樣緩沖液等體積混合，并將混合液在95℃，變性5min后，冰浴3min，得到變性的混合液，再將所述變性的混合液采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將分離后的擴增產物經過固定、銀染、顯色處理后記錄結果；

根據所述擴增產物的不同遷移距離確定每個所述品種豇豆的基因型，獲得如序列表中SEQ?ID?NO.1-SEQ?ID?NO.10所示的所述豇豆葉綠體微衛星分子標記的多態性引物。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增體系包括：1×PCR?buffer，20ng作為DNA模板的所述基因組DNA，4nmol?dNTP，30nmol?MgCl₂，0.5U?Taq?DNA聚合酶，10pmol所述豇豆葉綠體微衛星分子標記的多態性引物，所述PCR擴增體系的總體積為20μL。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增程序為：

94℃，預變性5min；

94℃，變性30s，50～59℃，退火30s，72℃，延伸40s，35個循環；

72℃，延伸5min。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述變性聚丙烯酰胺凝膠的質量分數為8%。

6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述上樣緩沖液包括：質量分數為98%的甲酰胺、濃度為10mmol·L^-1的EDTA、質量分數為0.025%的溴酚藍和質量分數為0.025%的二甲苯青藍。

7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，在采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離時，取所述變性的混合液2.5μL進行點樣。

8.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述電泳條件為：恒功率55W預電泳40min，然后恒功率50W電泳1.5h。

9.一種利用如權利要求1所述的多態性引物鑒定豇豆親緣關系的方法，其特征在于，所述方法包括：

提取所述不同品種豇豆的基因組DNA；

將所述豇豆葉綠體微衛星分子標記的多態性引物和所述基因組DNA混合并進行PCR擴增，得到擴增產物；

將所述擴增產物經采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，在同一電泳遷移位置上，若有DNA擴增條帶記為“1”，若無DNA擴增條帶記為“0”，統計結果；

對所述結果進行親緣關系分析。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述親緣關系的分析方法為：利用ntsys2.2軟件中的SimQual程序，計算DICE遺傳相似性系數矩陣，然后通SAHN程序中的非加權組平均法，構建遺傳關系聚類樹圖。